|
|
Funkce proteinu Slu7 v sestřihu pre-mRNA Saccharomyces cerevisiae
Ničová, Eva ; Půta, František (vedoucí práce) ; Vašicová, Pavla (oponent)
Alternativní sestřih je jedním z nástrojů regulace genové exprese. Za různých podmínek mohou z jednoho buněčného transkriptu vznikat různé mRNA kódující proteiny s různou funkcí, lokalizací či stabilitou. Lidský protein hSlu7 ovlivňuje alternativní sestřih některých genů prostřednictvím volby alternativních 3'sestřihových míst (3'SS). Ačkoli se původně zdálo, že kvasinky Saccharomyces cerevisiae alternativní sestřih nevyužívají, v poslední době se množí důkazy, že tomu tak není. Rozhodli jsme se proto blíže charakterizovat funkci kvasinkového Slu7, který se účastní druhého kroku sestřihu pre-mRNA a je úzce spjatý s volbou 3'SS. Pozornost jsme zaměřili na vysoce sekvenčně konzervovaný, doposud nepopsaný motiv v esenciální části proteinu, nazvaný motiv RED. Mutace v motivu způsobují defekt druhého kroku sestřihu některých substrátů a ovlivňují poměr využití alternativních 3'SS některých sestřihových konstruktů. Výsledky pokusů ukazují na roli motivu ve výběru především distálních 3'SS. Genetické interakce mutací slu7 s alelami genů PRP45 a PRP22 rozšiřují spletitou interakční síť sestřihových faktorů a naznačují možnou roli Slu7p ve vazbě Prp22p na spliceosom.
|
|
|
Exozóm a jeho role v metabolismu RNA v kvasinkách S. cerevisiae
Holická, Eliška ; Půta, František (vedoucí práce) ; Groušl, Tomáš (oponent)
Exozóm je proteinový komplex přítomný v jádře a cytoplazmě kvasinek podílející se na degradaci, úpravách a nastavení hladiny vzniku a zániku RNA. Jeho jádro se skládá z devíti katalyticky inaktivních podjednotek, se kterými fyzicky asociuje RNA nukleáza Rrp44. Funkce exozómu je závislá na mnoha kofaktorech, respektive fakultativně asociovaných enzymech, což zajišťuje jeho vysokou versatilitu. V různých kompartmentech buňky funguje odlišným způsobem a hraje roli v odlišných procesech. V jádře se podílí především na úpravách prekurzorů různých specializovaných RNA, kdežto v cytoplazmě hlavně na degradaci nativních mRNA. Jeho základní funkcí je ale ve všech těchto procesech exonukleolytické štěpení jednořetězcové RNA od 3' konce. Exozóm má své homology napříč organismy - různé druhy nukleáz v bakteriích, archeální exozóm, PM-Scl komplex (nebo také exozóm) u člověka, což implikuje vysokou konzervovanost této degradační mašinérie. Je tedy zřejmé, že exozóm u kvasinek není jejich evoluční novinkou, spíše naopak některé komponenty tohoto komplexu v průběhu evoluce ztratily svou původní funkci.
|
|
|
Sestřih atypických intronů v S. cerevisiae
Cit, Zdeněk ; Půta, František (vedoucí práce) ; Pichová, Alena (oponent)
Sestřih pre-mRNA je životně důležitý proces významný pro genovou expresi všech eukaryotických organismů. Pro správný průběh tohoto velmi složitého a dynamického děje je zapotřebí několik specializovaných RNA a velké množství proteinů, které zastávají nejrůznější úlohy nejen přímo uvnitř samotného sestřihového komplexu, ale i mimo něj. Jedním z proteinů účastnících se sestřihu pre-mRNA v kvasince Saccharomyces cerevisiae je i Prp45. Jeho lidským homologem je protein SNW1/SKIP, který se mimo sestřihu podílí i na celé řadě dalších funkcí. U proteinu Prp45 byla zatím spolehlivě popsána pouze účast na druhé transesterifikační reakci sestřihu. Objevily se však i informace naznačující jeho možné zapojení do první transesterifikační reakce. Tato práce přináší další poznatky spojující protein Prp45 s prvním sestřihovou reakcí, které byly získány výzkumem buněk nesoucích mutantní alelu prp45(1-169). Buňky nesoucí tuto alelu vykazují mimo zhoršeného sestřihu i akumulaci některých pre-mRNA. Tato práce se proto zabývala i možným vlivem proteinu Prp45 na export RNA z jádra do cytoplasmy. Nebylo však objeveno žádné spojení mezi transportem RNA a tímto proteinem. Klíčová slova sestřih pre-mRNA; Saccharomyces cerevisiae; Prp45; Mer1; Mud2; Prp22; Rrp6; AMA1; SNW1/SKIP
|
|
|
Úloha cyklofilinů v sestřihu
Cit, Zdeněk ; Půta, František (vedoucí práce) ; Novotný, Ivan (oponent)
Sestřih je proces nezbytný pro správné fungování eukaryotických buněk. Jedná se o velice složitý a dynamický děj, na němž se podílí velké množství proteinů, které plní různorodé funkce buď přímo uvnitř sestřihového komplexu, nebo i mimo něj. Mezi proteiny, které v sestřihu plní důležitou úlohu, patří nepochybně i cyklofiliny. Ty pravděpodobně způsobují konformační změny ostatních komponentů sestřihového komplexu, nebo je udržují v požadovaných konformacích, čímž přispívají k dynamice spliceosomu. Tato práce poskytuje přehled cyklofilinů, u nichž byl potvrzen podíl na sestřihu pre-mRNA, a shrnuje návrhy možných funkcí, jež tyto proteiny mohou v sestřihu zastávat.
|
|
|
Interakce proteinů Prp22 a Prp45 ve spliceosomu pučící kvasinky
Senohrábková, Lenka ; Půta, František (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent)
Protein Prp22 je DEAH box RNA helikáza, která má dvě funkce v sestřihu pre-mRNA: účastní se druhé transesterifikační reakce (ATP independentní funkce) a uvolňuje maturovanou mRNA ze spliceosomu (ATP dependentní funkce). Prp45p, kvasinkový ortholog lidského transkripčního koregulátoru SNW/SKIP, je esenciální sestřihový faktor, přítomný ve spliceosomu po celou dobu sestřihové reakce. Mutanta prp45(1-169) geneticky interaguje s některými alelami NTC komplexu a sestřihovými faktory druhého kroku, včetně PRP22. Jedním z výsledků této práce je zjištění, že mutanty prp22(-158T) a prp22(-327A), které jsou synteticky letální s mutací prp45(1-169), mají kvůli mutaci v upstream regulační oblasti sníženou hladinu proteinu Prp22. Mutanty prp22(-158T), prp22(300PPI) a prp22(-327A) ovlivňují sestřih pre-mRNA s mutací v 5'ss v závislosti na sekvenci druhého exonu. N-terminální mutanty prp22(∆301) a prp22(∆350) jsou synteticky letální s prp45(1-169). Syntetická letalita je možná způsobena snížením efektivity vazby Prp22p do spliceosomů na úroveň, která není pro buňky již viabilní.
|
|
|
DNA vazebné vlastnosti proteinů rodiny CSL ve Schizosaccharomyces pombe
Ptáčková, Martina ; Půta, František (vedoucí práce) ; Doležal, Pavel (oponent)
Transkripční faktory rodiny CSL (CBF1/RBP-Jκ/Suppressor of Hairless/Lag-1) jsou jako výkonná složka signální kaskády Notch podstatné pro mnohé vývojové procesy metazoálních organismů, ale mohou působit také nezávisle na Notch. V nedávné době byla jejich přítomnost prokázána v houbových organismech, které postrádají signalizaci Notch a také většinu známých metazoálních interakčních partnerů. Proteiny CSL jednobuněčné kvasinky Schizosaccharomyces pombe, Cbf11 a Cbf12, byly experimentálně určeny jako neesenciální jaderné transkripční faktory, které antagonistickým způsobem regulují buněčnou adhezi, produkci extracelulárního materiálu, morfologii kolonií, septaci a oddělování dceřiných buněk, koordinaci jaderného a buněčného dělení a udržování ploidie. Responzivní geny těchto faktorů dosud nejsou známé. V této práci byly predikovány geny S. pombe, jejichž promotorové oblasti představují možné přímé cíle pro vazbu proteinů Cbf. Vazba proteinů Cbf11, Cbf12 a také zkráceniny Cbf12∆N na vazebné elementy pro faktory CSL obsažené v regulačních oblastech vybraných genů S. pombe byla testována in vitro metodou EMSA a následně v případě proteinu Cbf11 in vivo metodou ChIP. Proteiny Cbf11 a Cbf12∆N sekvenčně specificky rozpoznávají vazebné elementy in vitro, ale jejich afinita, stejně tak jako jejich vazebné...
|
|
|
Sestřih intronu TUB3i v buňkách mutantních v genu PRP45
Konířová, Jana ; Půta, František (vedoucí práce) ; Zimmermannová, Olga (oponent)
Protein Prp45 kvasinek Saccharomyces cerevisiae představuje esenciální faktor podílející se na sestřihu pre-mRNA. Již dříve byla v naší laboratoři připravena zkrácená verze genu PRP45, prp45(1-169), vykazující termosensitivní fenotyp. Tato práce se pokouší přispět k lepší charakterizaci této mutanty. Testovali jsem citlivost buněk prp45(1-169) k inhibitoru polymerace mikrotubulů benomylu a následně jsme zjistili, že nadprodukce Tub3 z plasmidu nalezenou citlivost mutant prp45(1-169) k benomylu potlačuje. Dále jsem se zabývali vlivem delece intronů z genů TUB1, TUB3 a COF1 na citlivost buněk prp45(1-169) ke zvýšené teplotě. Pomocí metody RT-qPCR jsme zjistili, že v důsledku mutace prp45(1-169) dochází k výraznému zvýšení hladiny pre-mRNA všech sledovaných genů což by mohlo znamenat, že sestřih v těchto buňkách je poškozen již před první transesterifikační reakcí.
|
|
|
Role proteinu Prp45 v expresi a zrání mRNA
Abrhámová, Kateřina ; Půta, František (vedoucí práce) ; Pichová, Alena (oponent) ; Janderová, Blanka (oponent)
Souhrn Prp45p ze Saccharomyces cerevisiae a Snw1p ze Schizosaccharomyces pombe jsou pro eukaryotní buňku nepostradatelné proteiny, které vykazují vysoký stupeň homologie se savčím transkripčním regulátorem a nestřihovým faktorem SNW/SKIP. Analyzovali jsme esenciální funkci těchto proteinů v obou kvasinkách a nalezli mutaci (prp45(1-169)), která u mutantního kmen s odpovídající chromozomální delecí způsobuje citlivost vůči vyšší kultivační teplotě a hypersenzitivitu vůči cykloheximidu, hydroxymočovině, látce calcofluor white a inhibitorům polymerizace mikrotubulů. Při kultivaci ve 30řC jsou tyto kvasinky často prodloužené, deformované a větší než wt. Po synchronizaci ve 37řC zastavují kvasinky prp45(1-169) svůj růst s dvojnásobným obsahem DNA. Zjistili jsme, že teplotní senzitivita kmene prp45(1-169) není překonána a hypersenzitivita vůči mitotickým jedům je jen částečně potlačena odstraněním intronu z genu TUB1. To odlišuje prp45(1-169) od těch mutant v sestřihových faktorech, jež vykazují na tubulinu závislý blok v G2/M fázi, který může být překonán pomocí verze tub1 bez intronu . Pomocí analýzysestřihu in vitro jsme zjistili, že sestřih optimálních substrátů není narušen. Porovnávali jsme stabilitu a obsah RNA mezi prp45(1-169) a wt kvasinkami při různých teplotách pomocí microarray analýzy. Expresi a...
|
|
| |
|
|
Homeostáze kationtů alkalických kovů patogenních kvasinek rodu Candida
Elicharová, Hana ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent) ; Půta, František (oponent)
Kvasinky rodu Candida jsou oportunní patogeny schopné vyvolat závažné systémové infekce u imunokompromitovaných pacientů. Virulence jednotlivých druhů kan- did závisí mimo jiné na jejich odolnosti vůči proměnlivosti vnějšího prostředí. Udržování homeostáze kationtů alkalických kovů, čili na jedné straně schopnost akumulovat dostatečné množství draselných iontů a na straně druhé úspěšně čelit jejich vysoké extracelulární koncentraci, je nezbytné pro růst a virulenci kandid. V rámci této práce jsme popsali souvislost mezi tolerancí k solím a rezistencí k flukonazolu u šesti druhů kandid a možný mechanismus této interakce. Flu- konazol hyperpolarizuje plasmatickou membránu buněk kandid a zvyšuje tak nespecifický vstup kationtů alkalických kovů do buňky, čímž výrazně narůstá citli- vost kandid k solím těchto kationtů. Popsaný mechanismus má obecnou platnost, nebot' flukonazol zvyšuje senzitivitu kandid i k dalším kladně nabitým látkám, které vstupují do buňky v závislosti na velikosti membránového potenciálu. Účinek flukonazolu na membránový potenciál a tedy i na vstup kationtů alkalických kovů do buňky obrátil naši pozornost k homeostázi draselných kationtů, jejichž relativně vysoká...
|
host ::
RSS.