|
Vývoj a validace HPLC metody pro stanovení účinných látek a nečistoty v přípravku Valetol
Maroušková, Alena ; Sklenářová, Hana (oponent) ; Šatínský, Dalibor (vedoucí práce)
Tato práce navazuje na diplomovou práci (1) , ve které byly nalezeny optimální chromatografické podmínky pro stanovení účinných látek léčivého přípravku Valetol, paracetamolu, kofeinu a propyfenazonu, a nečistoty p-aminofenolu, metodou HPLC. Součástí rigorózní práce bylo nalezení vhodného vnitřního standardu pro přesnou kvantifikaci účinných látek a nečistoty, kyseliny benzoové. Následně byla provedena validace analytické metody, včetně testu vhodnosti chromatografického systému. V rámci testu vhodnosti chromatografického systému byla testována: účinnost kolony vyjádřená počtem teoretických pater N asymetrie chromatografických píků vyjádřená faktorem T rozlišení chromatografických píků opakovatelnost vyjádřená relativní směrodatnou odchylkou V rámci validace analytické metody byla testována: přesnost linearita správnost selektivita robustnost stabilita Test robustnosti prokázal citlivost analýzy na změnu složení mobilní fáze. Byly testovány dva parametry mobilní fáze: pH a změna obsahu triethylaminu. Bylo dokázáno, že změna pH mobilní fáze má vliv především na retenční časy p-aminofenolu a kyseliny benzoové. Změna obsahu triethylaminu v mobilní fázi má výrazný vliv jak na retenční čas p-aminofenolu, tak na velikost plochy píku p-aminofenolu (na jeho kvantifikaci). Požadavek na...
|
|
Vývoj automatizovaného SIA systému pro paralelní stanovení vybraných aniontů
Dundová, Aneta ; Solich, Petr (vedoucí práce) ; Šatínský, Dalibor (oponent)
Tato rigorózní práce je rozdělena do dvou částí, které spolu úzce souvisí. První část se zabývá optimalizací podmínek pro stanovení rozpuštěných křemičitanů metodou sekvenční injekční analýzy upravenou podle platné ISO normy pro metodu FIA, ve druhé, hlavní části práce se pojednává o vývoji automatizovaného SIA systému pro paralelní stanovení vybraných aniontů v komerčním SIA systému. Česká technická norma ČSN EN ISO 16 264 popisující metodu FIA pro stanovení rozpuštěných křemičitanů se spektrofotometrickou detekcí je založena na reakci vzorku obsahujícího rozpuštěné křemičitany s roztokem činidla (kyselý roztok heptamolybdenanu), který reaguje s křemičitany a fosforečnany za vzniku kyseliny molybdátokřemičité a molybdátofosforečné, která je následně rozložena roztokem kyseliny šťavelové. Kyselina molybdátokřemičitá se redukuje roztokem chloridu cínatého na výsledný produkt reakce - molybdenovou modř - měřený při vlnové délce 710 nm. V experimentální části práce bylo provedeno převedení uvedeného FIA stanovení do systému sekvenční injekční analýzy při dodržení kalibračních rozsahů uvedených v normě. Kalibrační křivky vykazovaly linearitu v rozmezí c = 0,2 - 2,0mg/l a c = 2,0 - 20,0mg/l s korelačními koeficienty R2 = 0,9982 a R2 = 0,9968. Při vývoji automatizovaného SIA systému pro paralelní...
|
|
Vývoj HPLC metody pro stanovení vitaminu E v přípravku geladrink
Švestková, Petra ; Chocholouš, Petr (oponent) ; Šatínský, Dalibor (vedoucí práce)
Byla vyvinuta HPLC metoda pro stanovení obsahu vitaminu E acetátu v přípravku Geladrink Forte práškový nápoj - ananas. Metoda je založena na využití kolony Chromolith Performance RP-18e (100 x 4,6 mm) a UV detekce p_i 290 nm. Vitamin E acetát byl separován v přítomnosti tokolu jako vnitřního standardu od matrice přípravku. Byla využita izokratická eluce mobilní fází methanol:voda (98:2), pr_toková rychlost mobilní fáze byla 1,5 ml/min. Měření probíhalo p_i 30 řC. Systém umožnil úspěšnou separaci v čase pod 5 min. Retenční _as tokolu byl 2,337 min a vitaminu E acetátu 4,271 min. Rozlišení chromatografických píků tokolu a vitaminu E acetátu bylo 7,515. Metoda byla dále využita pro analýzu vitaminu E acetátu v přípravku Chondrotin - MSM 2600. Stanovené koncentrace vitaminu E acetátu byly přepočítány na obsah vitaminu E, který deklaruje výrobce. Klíčová slova: vitamin E acetát, HPLC, Geladrink, Chondrotin - MSM 2600
|
|
Úprava vzorku pro stanovení alfa-tokoferolu v erytrocytární membráně vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií
Denková, Barbora ; Šatínský, Dalibor (oponent) ; Solich, Petr (vedoucí práce)
V této rigorózní práci byla vyvinuta nová metoda umožňující izolaci α-tokoferolu z membrán lidských erytrocytů pro následné stanovení tohoto vitaminu vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s využitím ultracentrifugace a extrakce na tuhou fázi (SPE). Právě SPE je dnes jedna z nejúčinnějších a nejspolehlivějších moderních metod umožňujících vhodnou úpravu vzorku biologického materiálu před chromatografickou analýzou. Vyvinutý postup SPE je následující: 1) Promytí odebraných erytrocytů: 2,5 ml nesrážlivé krve centrifugujeme 10 min při 1300×g, 4˚C a horní vrstvu plasmy oddělíme. K erytrocytům přidáme roztok 0,01% BHT ve fyziologickém roztoku do objemu 2,5 ml a centrifugaci zopakujeme. Odstraníme supernatant a celý postup opakujeme třikrát. Promyté erytrocyty skladujeme při teplotě -86˚C. 2) Vlastní extrakce α-tokoferolu z promytých erytrocytů: Do ultracentrifugační kyvety napipetujeme 500 μl 50 mmol/l roztoku D-mannitolu a 500 μl 5 mmol/l HEPESu. Poté odebereme 100 μl rozmražených promytých erytrocytů pomocí pístové pipety, pipetu zvenku pečlivě otřeme buničinou a erytrocyty vpravíme do kyvety. Následně přidáme 11 μl 1 mol/l roztoku CaCl2 a vzorek ultracentrifugujeme 3 minuty, při 90 000 rpm (288 000×g, rAV = 31,8 mm) a 4žC. Po vyjmutí vzorku z ultracentrifugy odpipetujeme 500 μl supernatantu...
|
|
HPLC stanovení luteinu, zeaxanthinu a betakarotenu v potravních doplňcích
Dvořáková, Petra ; Šatínský, Dalibor (vedoucí práce) ; Chocholoušová Havlíková, Lucie (oponent)
Tato rigorózní práce se zabývá úpravou metody separace karotenoidů luteinu, betakarotenu a zeaxanthinu převzaté z diplomové práce (Optimalizace chromatografických podmínek pro HPLC stanovení vybraných karotenoidů, Petra Dvořáková, 2009). Základní metodou je HPLC s VIS detekcí. Úprava spočívala ve vyvinutí gradientové eluce pro zkrácení doby analýzy. Při optimalizaci postupu gradientové eluce byly testovány čtyři způsoby. Druhým úkolem této rigorózní práce je shrnutí extrakčních způsobů pro vybrané karotenoidy, které byly publikovány v odborné literatuře a navržení způsobů extrakce vhodných pro izolaci karotenoidů z potravních doplňků. Při hledání optimálního způsobu extrakce byla využívána extrakce organickými rozpouštědly. Zkoušena byla jak prostá extrakce do organického rozpouštědla, tak extrakce s předchozí úpravou vzorku saponifikací nebo okyselením extrakčního prostředí. Přes vyzkoušení celé řady postupů a organických rozpouštědel se nepodařilo nalézt optimální a univerzální způsob extrakce karotenoidů z lékových forem.
|
|
Aplikace SPE a technologie monolitních kolon v HPLC analýze biologicky aktivních látek
Horčičková, Šárka ; Šatínský, Dalibor (oponent) ; Solich, Petr (vedoucí práce)
Extrakce na pevnou fázi (SPE) představuje účinnou, spolehlivou a selektivní moderní metodu pro úpravu vzorku biologického materiálu před chromatografickou analýzou. V diplomové práci byla vyvinuta nová metoda SPE pro izolaci vitaminu D2 (ergokalciferol), D3 (cholekalciferol) a metabolitu 25-(OH)D3 (kalcidiol) z lidského séra současně s vitaminy A (retinol) a E ( - tokoferol). Jednotlivé vitaminy byly následně stanoveny již vyvinutou a validovanou metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Vyvinutý postup SPE: Do skleněné zkumavky napipetujeme 250 l séra a přidáme 1000 l ethanolu o teplotě 4řC. Vzorek protřepeme a necháme 10 minut deproteinovat v chladničce při teplotě 4řC, poté zcentrifugujeme (4 000 x g, 15 minut, 4řC). Opatrně odebereme supernatant a naneseme na předem připravenou SPE kolonku (promytí 1 ml methanolu následně 1 ml destilované vody). Během těchto dvou kroků nesmí dojít k vyschnutí sorbentu kolonky. Vitamíny eluujeme 1,5 ml methanolu a následně 2 ml hexanu. Eluát odpaříme v koncentrátoru při teplotě 45řC. Odparek rozpustíme v 250 l methanolu a analyzujeme již vyvinutou HPLC metodou. Optimalizovaná HPLC metoda: Mobilní fáze - A: methanol:voda:2-propanol (75:15:10) 3,0 ml/min, 0.-3. minuta, B: methanol:voda (95:5) 3,5 ml/min, 3.- 6,5. minuta; kolona - monolitní kolona...
|
|
HPLC separace p-aminofenolu, paracetamolu, kofeinu a propyfenazovu na polární stacionární fázi
Maroušková, Alena ; Sklenářová, Hana (oponent) ; Šatínský, Dalibor (vedoucí práce)
V této práci byly nalezeny optimální chromatografické podmínky pro separaci p-aminofenolu, paracetamolu, kofeinu a propyfenazonu pomocí metody HPLC. Jde o látky vzájemně se lišící lipofilitou a acidobazickými vlastnostmi. Použití klasických kolon s reverzní fází je pro jejich společné stanovení problematické. PEG kolona se ukázala jako vhodná pro efektivní separaci látek s odlišnou polaritou, tedy s různým chromatografickým chováním. Výhodou výsledné metody je především zkrácení doby analýzy, což hraje významnou roli zejména při analýzách velkých sérií vzorků. V rámci optimalizace chromatografických podmínek: byl vyzkoušen široký výběr mobilních fází (různá organická rozpouštědla, různý poměr zastoupení organické složky ke složce vodné) bylo testováno pH mobilní fáze v rozmezí 4 - 7 byly testovány různé pufry bylo vyzkoušeno chování látek na koloně při zvýšené teplotě byly testovány dvě PEG kolony s rozdílnými délkami Byly nalezeny optimální chromatografické podmínky, při kterých dojde k separaci výše uvedených látek a které současně vyhovují požadavkům na jednoduchost a časovou nenáročnost při zachování vysoké spolehlivosti metody. Konečné chromatografické podmínky: Stacionární fáze: Supelco Discovery HS PEG kolona (15 x 4 mm, 3 µm) Mobilní fáze: octanový pufr o pH 4,5 s obsahem 0,04%...
|
|
Optimalizace podmínek pro kvalitativní a kvantitativní analýzu farnesolu a tyrosolu pomocí UPLC-MS/MS.
Greguš, Petr ; Šatínský, Dalibor (oponent) ; Nováková, Lucie (vedoucí práce)
VYUŽITÍ TECHNIKY UHPLC/MS/MS PRO KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ ANALÝZU FARNESOLU A TYROSOLU, JAKO PRODUKTŮ METABOLISMU KVASINKY CANDIDA ALBICANS Petr Greguš 1 , Lucie Nováková 1 1 Universita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Heyrovského 1203, 50005 Hradec Králové ABSTRAKT : Candida albicans je obecně jedna z nejčastěji izolovaných houbovitých patogenů v lidském těle. Je obecný původce nosokomiálních nákaz, infekcí krevního oběhu, urinárních infekcí a infekcí zažívacího traktu. Jedno z nejčastějších infekčních onemocnění je vulvovaginální kandidóza, která postihuje většinu zdravé populace žen. Candida albicans může růst jako hyfa, pseudohyfa, nebo rašící kvasinka. Dosažitelnost této různorodosti - vnitřní proměnlivosti morfologie je velkým přínosem pro patogenní život tohoto organismu. Změna morfologické formy z kvasinkové (blastospóry) na pseudomyceliární nebo myceliární (hyfovou) charakterizuje přechod z koloniálního statutu na invazivní. Vedle fyzikálně-chemických faktorů, zasahují do těchto transformačních dějů i quorum sensing látky - farnesol, který pokud je akumulován nad určitou mez, zabraňuje přeměnu z kvasinky na mycelium a tyrosol, který urychluje přeměnu v zárodečnou formu (germ tubes), tedy z kvasinky na vláknitou formu. Tato diplomová práce se zabývá vypracováním...
|
|
Porovnání možností UV a CAD detekce u vybraných skupin látek
Vrkočová, Kateřina ; Šatínský, Dalibor (oponent) ; Nováková, Lucie (vedoucí práce)
Tato diplomová práce byla zaměřena na porovnání možností UV a CAD detekce u vysoko účinné kapalinové chromatografie. Separace estrogenních steroidů a fenolických kyselin byla provedena na koloně Zorbax SB C18 (50x 4,6 mm; 1,8 µm). Stanovení probíhalo za současného použití dvou typů detekce: ultrafialová detekce (UV) a detekce nabitého aerosolu (Charged aerosol detection; CAD). V rámci optimalizace metody byly zjišťovány vhodné podmínky pro stanovení estrogenních steroidů a fenolických kyselin, zejména se zaměřením na dobrou citlivost CAD detektoru. Byl sledován vliv složení a koncentrace vodné složky mobilní fáze, rychlosti průtoku mobilní fáze a nastavení rozsahu CAD na jeho odezvu. Ke stanovení estrogenních steroidů byla použita gradientová eluce. Mobilní fáze se skládala z 0,1% kyseliny octové a acetonitrilu. Ke stanovení fenolických kyselin byla použita gradientová eluce. Mobilní fáze se skládala z 0,5% kyseliny mravenčí a metanolu. Součástí této diplomové práce bylo ověření vhodnosti použití detektoru Corona CAD. Za optimalizovaných podmínek umožňuje CAD současnou detekci β - estradiolu a jeho pěti možných nečistot. Při současném stanovení deseti fenolických kyselin CAD detekce neposkytla relevantní výsledky pro nejdéle eluovanou kyselinu skořicovou. Metoda pro estrogenní steroidy byla...
|
| |