|
| |
|
|
Vývoj biosenzoru pro fosfatidylinositol
Eisenreichová, Andrea ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Petráčková, Denisa (oponent)
Fosfatidylinositol je minoritním komponentem membrán eukaryotických buněk. Vedle strukturní funkce má i zásadní roli v buněčné signalizaci jako prekursor několika signalizačních molekul a sekundárních poslů. Jedná se o fosfoinositidy, které vznikají fosforylací hydroxylových skupin fosfatidylinositolu v pozicích 3,4 a 5 inositolového kruhu. I přes důležitou roli fosfatidylinositolu však zůstává jeho prostorová a časová a dynamika v buňce nevyjasněná, především z důvodu neexistence odpovídající specifické optické próby (biosenzoru) pro jeho vizualizaci. Pro konstrukci biosenzorů pro inositolové fosfolipidy se využívají lipid-vazebné domény jejich efektorových proteinů s dostatečnou afinitou a specifitou pro daný fosfoinositid. Pro fosfatidylinositol takováto doména není známa, ale je znám enzym, bakteriální fosfatidyl-inositol specifická fosfolipasa C, který se na PI specificky váže. Tento enzym následně katalyzuje hydrolýzu fosfatidylinositolu za vzniku diacylglycerolu a inositol 1-fosfátu a na rozdíl od eukaryotických homologů neštěpí fosforylované formy fosfatidylinositolu. Cílem této diplomové práce bylo vyřešit modely struktur komplexů několika neaktivních mutantních forem fosfolipasy C z Bacillus cereus s myo-inositolem, které by dále sloužily jako podklad pro konstrukci geneticky...
|
|
|
Produkce a sekrece faktorů virulence Bordetella pertussis
Držmíšek, Jakub ; Večerek, Branislav (vedoucí práce) ; Petráčková, Denisa (oponent)
Bordetella pertussis je lidský patogen, který způsobuje infekční onemocnění nazývané černý či dávivý kašel. K úspěšné infekci a kolonizaci hostitele využívá řadu faktorů virulence, jako jsou toxiny (adenylát cyklázový toxin, pertuzový toxin) a adheziny (filamentózní hemaglutinin, pertaktin, fimbrie). Kromě těchto hlavních faktorů byl u rodu Bordetella nalezen také sekreční systém typu 3 (T3SS), který má schopnost dopravit efektorové proteiny přímo do cytoplazmy hostitelské buňky. V návaznosti na naší předchozí charakterizaci delečního mutanta genu kódujícího RNA chaperonu Hfq (Δhfq), která prokázala, že protein Hfq je nezbytný pro řádnou funkci T3SS, byly připraveny a purifikovány rekombinantní proteiny BopB, BopD, BopC, BopN. Jejich pomocí byly získány specifické protilátky potřebné ke studiu funkčnosti sekrečního systému a buněčné lokalizace těchto proteinů. Pomocí získaných protilátek byla poprvé detekována in vitro sekrece proteinu BopC kmenem B. pertussis po pasáži v lidských makrofázích. Rovněž byly využity izolované rekombinantní translokátory BopB a BopD k testování jejich pórotvorné aktivity. Dále byla porovnána produkce proteinů v divokém a Δhfq kmenu před i po pasáži v lidských makrofázích. Byly zjištěny rozdíly v množství sekretovaných a membránových proteinů a některé z těchto proteinů...
|
|
|
Studium interakce houby Pleurotus ostreatus a bakteriálních kultur na abiotickém nosiči - morfologická, biochemická a proteomická analýza
Kozická, Barbora ; Petráčková, Denisa (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Ligninolytické houby jsou významné svými biodegradačními schopnostmi, které lze využít při odstraňování mnoha významných polutantů z životního prostředí, včetně průmyslových barviv. Jako zástupce této skupiny hub byl vybrán Pleurotus ostreatus a byla vytvořena modelová situace pro jeho průmyslové využití při dekolorizaci textilního barviva Remazol Brilliant Blue R (RBBR), které je odpadním produktem textilního průmyslu. Houba byla imobilizována na inertním nosiči (kostky polyuretanové pěny) v neprůtokovém "fixed- bed" bioreaktoru a byla simulována kontaminace houbového filtru bakteriemi, kterou lze předpokládat v praktické aplikaci při čištění odpadních vod. Jako modelová bakterie byla zvolena bakterie Rhodococcus erythropolis. Cílem této práce bylo studium vzájemných interakcí houby a bakterie v bioreaktoru při dekolorizaci barviva. Degradační schopnosti houby byly sledovány na základě produkce ligninolytických enzymů, jež se uplatňují v procesu dekolorizace. Při pozorování růstu směsné kultury houby a bakterie v bioreaktoru bylo zjištěno, že R. erythropolis v kokultuře s P. ostreatus nerostl, došlo k vymizení bakterií z kultivační tekutiny. Bylo prokázáno, že ani vysoká koncentrace houbového enzymu lakázy v médiu, změna pH média vlivem růstu P. ostreatus nebo snížení množství glukózy v médiu...
|
|
|
Tvorba biofilmu u Streptococcus pneumoniae
Jarošová, Václava ; Petráčková, Denisa (vedoucí práce) ; Matyska Lišková, Petra (oponent)
Biofilm je strukturované společenství buněk adherovaných k povrchu či k sobě navzájem a obklopených extracelulární matrix. Tvorba biofilmu probíhá v několika krocích od jednotlivých buněk adherovaných k povrchu až po mikrokolonie propojené kanály. Přítomnost biofilmu na zdravotnických materiálech a obtíže při léčení bakteriálních infekcí spojených s výskytem biofilmu jsou stále aktuálním problémem, kvůli zvýšené rezistenci těchto bakterií k antimikrobiálním látkám. V centru našeho zájmu je bakterie tvořící biofilm Streptococcus pneumoniae. Jedná se o podmíněně patogenní bakterii, která kolonizuje horní cesty dýchací a způsobuje řadu nemocí. Biofilmy tvořené bakterií S. pneumoniae vykazují zvýšenou rezistenci k antibiotikům, a proto jsou v posledních letech studovány alternativní antimikrobiální látky. Ke studiu biofilmu jsou používané kultivační systémy otevřené i uzavřené. K otevřeným patří "flow cell" a biofilmové reaktory, mezi uzavřené řadíme "Calgary biofilm device" a Christensenovu metodu v mikrotitračních destičkách.
|
|
|
Rezistence k antibiotikům u klinicky významných kmenů rodu Enterococcus
Kozická, Barbora ; Petráčková, Denisa (vedoucí práce) ; Motlová, Lucia (oponent)
Rod Enterococcus je běžnou součástí mikroflóry zažívacího traktu, bývá využíván v potravinářství a je přidáván i do probiotik, ale v posledních několika desetiletích se dostává do popředí zejména jako původce nosokomiálních onemocnění. Jeho význam roste se zvyšující se rezistencí k antibiotikům. Enterococcus je přirozeně rezistentní k řadě antibiotik a mutacemi nebo horizontálním přenosem genů může získávat další rezistenční determinanty. Největší klinický význam mají Enterococcus faecium a Enterococcus faecalis, proto se tato práce zaměřuje na přirozené i získané rezistence těchto dvou kmenů. Největší pozornost je v práci věnována rezistenci k antibiotikům vankomycin a linezolid. Vankomycin představoval po několik desetiletí poslední možnost léčby při selhání obvykle užívaných antibiotik, ale rychle se šířící rezistence k tomuto antibiotiku znamenala velký problém. Antibiotikum linezolid bylo vyvinuto jako odpověď na rostoucí rezistenci k dostupným antibiotikům u grampozitivních bakterií obecně a účinně působí proti vankomycin-rezistentním kmenům E. faecium a E. faecalis.
|
|
|
Využití gelově-založených proteomových technik při analýze genové exprese u prokaryotních a eukaryotních modelů
Petráčková, Denisa ; Weiser, Jaroslav (vedoucí práce) ; Nešvera, Jan (oponent) ; Stulík, Jiří (oponent)
Tato dizertační práce ukázala možnosti využití gelově-separační techniky 2-DE při řešení tří nezávislých vědeckých projektů. Proteomické studie vhodně doplnily výsledky získané i jinými přístupy a přispěly k celkovému zobrazení proteinové situace v daných biologických systémech. Srovnáváním celkového proteomu E. coli bylo identifikováno 61 proteinových změn v souvislosti s vývojem bakteriální populace v přítomnosti antibiotika erytromycinu. Tento "klasický" experiment zahrnoval vhodnou izolaci vzorku, separaci a analýzu bílkovin pomocí 2-DE s následnou identifikací proteinů pomocí MS. Nevýhodou bylo velké množství výsledných dat, které bylo potřeba zpracovat (počítačovou analýzou dat). Naproti tomu v případě studia membránového proteomu B. subtilis při pH stresu bylo třeba primárně modifikovat metodu izolace membránových a s membránou asociovaných bílkovin pro jejich vhodnou separaci na 2-DE Optimalizace zahrnovala především úpravy v použitých chemikáliích-detergentech podílejících se na solubilizaci proteinů a časové prodloužení tohoto procesu. Detegováno bylo následně 5 významných proteinových změn v odpovědi na pH stres týkajících se proteinů AcoB, SodA, YjcH, YwaC a YkwC. Data byla doplněna údaji o rigidizaci membrány B. subtilis v kyselém prostředí (stanoveno pomocí pulzní časově rozlišená...
|
host ::
RSS.