|
|
Strukturní determinanty regulace povrchového transportu NMDA receptorů v savčích buňkách
Danačíková, Šárka ; Horák, Martin (vedoucí práce) ; Bendová, Zdeňka (oponent)
N-methyl-D-aspartátové (NMDA) receptory jsou ligandem otevírané iontové kanály aktivované agonistou glutamátem a koagonistou glycinem. Mají klíčovou roli ve zprostředkování rychlého excitačního synaptického přenosu v centrální nervové soustavě savců. Pro vytvoření funkčního receptoru je nutná přítomnost dvou GluN1 podjednotek, které se společně s GluN2 nebo GluN3 podjednotkami skládají do formy heterotetramerů. Předchozí studie potvrdily důležitost M3 transmembránového helixu a extracelulárně lokalizovaných cysteinů v regulaci povrchové exprese funkčních NMDA receptorů. Cílem mé práce je objasnit vliv klinicky relevantních mutací lokalizovaných v M3 transmembránovém helixu a roli všech známých cysteinů tvořících disulfidické můstky na povrchový transport NMDA receptorů exprimovaných v heterologní buněčné linii opičích ledvinných fibroblastů (COS-7). Pomocí molekulárně-biologických, imunocytochemických a mikroskopických metod jsem zjistila, že klinicky relevantní mutace M641I a Y647S v GluN1 podjednotce a mutace konkrétních cysteinů tvořící disulfidické můstky v GluN1, GluN2A a GluN2B podjednotkách způsobily výrazné snížení počtu povrchově exprimovaných NMDA receptorů. Dále jsem zjistila, že vliv mutovaných GluN1 podjednotek na snížení povrchového transportu závisí na podjednotkovém složení receptorů....
|
|
|
Functional and pharmacological properties of GluN1/GluN2 and GluN1/GluN3 subtypes of NMDA receptors
Kolcheva, Marharyta ; Horák, Martin (vedoucí práce) ; Bohačiaková, Dáša (oponent) ; Balaštík, Martin (oponent)
(CZ) N-methyl-D-aspartátové receptory (NMDAR) jsou ionotropní glutamátové receptory, které hrají klíčovou roli v excitačním synaptickém přenosu v centrálním nervovém systému (CNS) savců. Zvýšená ale i snížená aktivita NMDAR může způsobit široké spektrum patologických stavů a psychiatrických poruch jako například Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, Huntingtonovu chorobu, epilepsii nebo schizofrenii. NMDAR tvoří heterotetramerní komplexy složené z podjednotek GluN1, GluN2(A-D) a/nebo GluN3(A, B). Různé podtypy NMDAR mohou mít rozdílný vliv na patogenezi onemocnění, a proto je zásadní zkoumat specifickou roli jednotlivých podjednotek v regulaci normálního fungování NMDAR. Regulace NMDAR probíhá na různých úrovních, od raného zpracování, včetně syntézy, sestavení, kontroly kvality v endoplazmatickém retikulu (ER) a přesunu na povrch buňky až po internalizaci, recyklaci a degradaci receptoru. V této disertační práci jsme se zaměřili především na určení role extracelulárních a transmembránových oblastí různých podtypů NMDAR na regulaci jejich funkce. Konkrétně jsme pomocí elektrofyziologických a mikroskopických metod na buňkách HEK293 a kultivovaných hipokampálních neuronech zkoumali: (i) vliv N- glykosylace a různých lektinů na regulaci funkčních vlastností receptorů GluN1/GluN3; (ii) vliv...
|
|
|
Vlivy neurosteroidů na intracelulární vápník a excitotoxicitu
Naimová, Žaneta ; Smejkalová, Terézia (vedoucí práce) ; Adámek, Pavel (oponent)
NMDA receptory patří do skupiny ionotropních glutamátových receptorů a jsou zapojeny v procesu synaptické plasticity, učení a paměti. Jejich nadměrná aktivace agonistou glutamátem ale může vést ke smrti neuronů - excitotoxicitě. Excitotoxicita vzniká jako následek nadměrného vtoku vápníku NMDA receptory a je spojována s mnoha patologiemi centrální nervové soustavy (CNS). Neurosteroidy jsou endogenní látky schopné modulovat NMDA receptory, nabízí se proto jejich možné farmakologické využití při léčbě poruch CNS. Cílem této práce bylo zjistit vliv neurosteroidů pregnanolon sulfátu (PA-S) a pregnanolon hemipimelátu (PA-hPim) na somatický vápník a na excitotoxicitu. Pro měření koncentrace somatického vápníku jsme používali mikrospektrofluorimetrickou metodu. Zjistili jsme, že PA- S nemá vliv na relativní koncentraci somatického vápníku. Jeho syntetický analog PA-hPim hladinu mírně zvyšoval. Vliv neurosteroidů na excitotoxicitu byl zkoumán v modelu kyslíkovo- glukózové deprivace (OGD) in vitro. V modelu akutní excitotoxicity byly oba testované neurosteroidy neuroprotektivní. V modelu ischemické tolerance PA-S i PA-hPim navozovaly toleranci k následnému OGD. Naše výsledky ukazují, že neurosteroidy PA-S i PA-hPim mají potenciál pro léčbu excitotoxicitou způsobených poruch CNS.
|
|
|
Computational Studies of Interactions of Small Molecules with their Biological Targets
Nekardová, Michaela ; Hobza, Pavel (vedoucí práce) ; Berka, Karel (oponent) ; Kabeláč, Martin (oponent)
Práce je zaměřena na výpočetní analýzu farmaceuticky zajímavých látek v interakci s jejich biologickými cíli. Velké množství léčiv jsou malé molekuly, které se do aktivního místa enzymu vážou na principu "zámku (enzym) a klíče (léčivo)" prostřednictvím nekovalentních interakcí a způsobují tak vzestup nebo pokles aktivity enzymu. Hlavní téma práce se věnuje objasnění strukturních základů interakcí purinových analogů s enzymem cyklin-dependentní kinázou 2, který patří do protein-kinázové rodiny. Tyto enzymy hraji důležitou roli v regulaci buněčného cyklu, zvýšení jejich aktivity zásadním způsobem přispívá ke ztrátě kontroly nad buněčnou proliferací, což je jedna z příčin tvorby rakovinových buněk. Studie popisuje vazebné motivy roskovitinu, látky s inhibičním účinkem na funkci cyklin-dependentních kináz, a jeho analogů s biosterickými centrálními heterocykly v interakci s cyklin-dependentní kinázou 2. Vazebná afinita mezi enzymem a inhibitory je kvantifikována jako vypočtené vazebné skóre a vyhodnocena ve vztahu ke konformaci optimalizovaných struktur. Pro výpočty byl použit hybridní model kombinující kvantově mechanickou - QM (DFT-D) a semiempirickou kvantově mechanickou - SQM (PM6-D3H4X) metodu. Solvatační efekt byl popsán implicitním solvatačním modelem COSMO na SQM úrovni pro celý systém. Druhé...
|
|
|
Možnosti ovlivnění vývoje motoriky laboratorního potkana opakovaným podáváním specifického antagonisty NMDA receptoru
Kozlová, Lucie ; Mareš, Pavel (vedoucí práce) ; Valeš, Karel (oponent)
Antagonisté NMDA receptoru vyvolávají u laboratorních potkanů hyperlokomoci. Cílem této práce je zjistit, jestli tento účinek nespecifických antagonistů vykazuje i antagonista NMDA receptoru specifický pro NR2 podjednotku. Tato podjednotka převládá v mozku v časném postnatálním období. V rešeršní části práce jsou shrnuty poznatky o NMDA receptorech a o vývoji laboratorního potkana. Experimentální část se věnuje působení specifického antagonisty NMDA receptoru Ro 25-6981 na motoriku zvířat. Látku jsme opakovaně podávali mláďatům laboratorního potkana od 7. do 11. postnatálního dne. Tato zvířata byla do dospělosti opakovaně testována baterií testů vhodných pro určitý věk na spontánní a reflexní motoriku a srovnávána s kontrolní skupinou zvířat. Náš výzkum ukázal, že látka nemá na hrubou motoriku laboratorního potkana významný účinek a zůstává vážným kandidátem na věkově vázané antiepileptikum.
|
|
|
Účinky sulfatovaných neurosteroidů na proteiny účastnící se excitačního synaptického přenosu
Naimová, Žaneta ; Smejkalová, Terézia (vedoucí práce) ; Mrózková, Petra (oponent)
Objev steroidních látek, které jsou schopny se v CNS a PNS syntetizovat anebo akumulovat, vedl z otázce, jakou zde mají funkci. Neurosteroidní látky mají schopnost modulovat synaptický přenos. Působení je rychlé a přímé, zprostředkované skrze negenomické mechanismy. Účinek těchto látek je znám na celou řadu kanálů a receptorů - excitačních i inhibičních. Tato práce shrnuje poznatky o působení sulfatovaných neurosteroidů na proteiny účastnících se excitačního synaptického přenosu. V práci jsou zahrnuty poznatky o působení na ionotropní glutamátové receptory, TRP kanály, metabotropní receptory, sodné a draselné kanály. Nadměrná nebo nedostatečná aktivita těchto proteinů zapojených do synaptického přenosu může vést k patologickým stavům. Cílem této práce je shrnout poznatky o působení těchto látek, poukázat na strukturní a funkční charakteristiky pravděpodobně zodpovědných za jejich účinek a zároveň nastínit jejich možné farmakologické užití.
|
|
|
Vliv neuroaktivních steroidů inhibujících NMDA receptory na chování
Chvojková, Markéta ; Valeš, Karel (vedoucí práce) ; Mareš, Pavel (oponent)
Neuroaktivní steroid pregnanolon glutamát (Pg glu), syntetický analog přirozeně se vyskytujícího pregnanolon sulfátu (3alfa5betaS), má neuroprotektivní vlastnosti a minimum nežádoucích účinků. Předmětem mé práce je vliv zvolených strukturálních modifikací molekuly Pg glu na biologické účinky. První modifikací je zvýšení lipofility, druhou pak připojení kladně nabité skupiny na C3. Všechny tyto neuroaktivní steroidy jsou use-dependentními inhibitory NMDA receptorů. Prvním cílem práce bylo zjistit neuroprotektivní účinnost zvolených neuroaktivních steroidů. Druhým cílem bylo prozkoumat vliv vybraných neuroaktivních steroidů na motorickou koordinaci, reflexy, anxietu, lokomoční aktivitu a také účinky jejich vysokých dávek. Třetí cíl představovalo sestavení baterie behaviorálních testů pro screening biologických účinků analogů Pg glu u laboratorních hlodavců. Neuroprotektivní účinky byly hodnoceny v modelu excitotoxického poškození hipokampu u potkana na základě jeho behaviorálních důsledků. Neuroprotektivní účinnost byla prokázána u androstan glutamátu (And glu) a Pg glu. U kladně nabitých molekul neuroprotektivní účinnost prokázána nebyla. V neuroprotektivních dávkách (1 mg/kg) neměl And glu ani Pg glu nežádoucí vliv na motoriku, reflexy ani lokomoční aktivitu. Tyto poznatky svědčí pro význam výzkumu a vývoje...
|
|
|
Synthesis and Properties of Neuroactive Steroids
Kapras, Vojtěch
Souhrn V této práci je popsána syntéza molekulárních sond pro výzkum činnosti neuroaktivních steroidů in vitro a v živých organismech. V první části je zkoumána syntéza enantiomerních pregnanových steroidů, vedoucí k přípravě ent-progesteronu. Chiralita cílové molekuly je zavedena pomocí vysoce efektivní organokatalytické asymetrické Robinsonovy anelace. Jako klíčový krok je zde prozkoumána nová metoda postupné konstrukce 5-členného karbocyklu. Tato sestává ze substrátem řízené konjugované adice katalyzované mědí, následné radikálové oxygenace a termální cyklizace s využitím efektu perzistentního radikálu. Dále je v práci popsána příprava zkrácených analog neurosteroidů a jejich biologická aktivita na NMDA receptoru je srovnána s přirozeným hormonem. V druhé části je zkoumána metodologie specifického značení obou angulárních methylů 5β- pregnanového steroidního skeletu deuteriem. Zvláštní pozornost je zde věnována Barton- McCombie deoxygenaci jakožto nástroje pro zavedení posledního atomu deuteria do methylové skupiny. Obě pozice byly značeny celkovým počtem tří atomů deuteria ve vysoké izotopické čistotě.
|
|
|
Molekulární mechanismy regulace transportu a funkce různých podtypů NMDA receptorů v hipokampálních neuronech
Skřenková, Kristýna ; Horák, Martin (vedoucí práce) ; Balík, Aleš (oponent) ; Bendová, Zdeňka (oponent)
dizertační práce Molekulární mechanismy regulace transportu a funkce různých podtypů NMDA receptorů v hipokampálních neuronech Mgr. Kristýna Skřenková N-methyl-D-aspartátové (NMDA) receptory jsou ionotropní glutamátové receptory, které mají klíčovou úlohu v savčí centrální nervové soustavě. Za fyziologických podmínek jsou tyto receptory důležité pro excitační synaptický přenos a tvorbu paměťových stop. Za patologických podmínek může ovšem jejich abnormální regulace, či aktivace vést k mnohým neurologickým a psychiatrickým onemocněním, jako je například Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, Huntingtonova choroba, epilepsie, nebo schizofrenie. Množství NMDA receptorů na povrchové membráně buněk je regulováno na několika úrovních, zahrnujících jejich syntézu, skládání, internalizaci, či degradaci. Během transportu na buněčnou membránu dochází rovněž ke kontrole vazby agonistů a správné aktivace NMDA receptorů. Současně dochází u NMDA receptorů k celé řadě posttranslačních modifikací, jako je palmitoylace, fosforylace, nebo N-glykosylace. V této dizertační práci jsme se zabývali studiem molekulárních mechanismů, které mohou ovlivnit transport a funkční vlastnosti NMDA receptorů v savčích buňkách a potkaních hipokampálních neuronech. Konkrétně jsme podrobně studovali i) roli N-glykosylace u GluN1,...
|
|
|
Computational Studies of Interactions of Small Molecules with their Biological Targets
Nekardová, Michaela ; Hobza, Pavel (vedoucí práce) ; Berka, Karel (oponent) ; Kabeláč, Martin (oponent)
Práce je zaměřena na výpočetní analýzu farmaceuticky zajímavých látek v interakci s jejich biologickými cíli. Velké množství léčiv jsou malé molekuly, které se do aktivního místa enzymu vážou na principu "zámku (enzym) a klíče (léčivo)" prostřednictvím nekovalentních interakcí a způsobují tak vzestup nebo pokles aktivity enzymu. Hlavní téma práce se věnuje objasnění strukturních základů interakcí purinových analogů s enzymem cyklin-dependentní kinázou 2, který patří do protein-kinázové rodiny. Tyto enzymy hraji důležitou roli v regulaci buněčného cyklu, zvýšení jejich aktivity zásadním způsobem přispívá ke ztrátě kontroly nad buněčnou proliferací, což je jedna z příčin tvorby rakovinových buněk. Studie popisuje vazebné motivy roskovitinu, látky s inhibičním účinkem na funkci cyklin-dependentních kináz, a jeho analogů s biosterickými centrálními heterocykly v interakci s cyklin-dependentní kinázou 2. Vazebná afinita mezi enzymem a inhibitory je kvantifikována jako vypočtené vazebné skóre a vyhodnocena ve vztahu ke konformaci optimalizovaných struktur. Pro výpočty byl použit hybridní model kombinující kvantově mechanickou - QM (DFT-D) a semiempirickou kvantově mechanickou - SQM (PM6-D3H4X) metodu. Solvatační efekt byl popsán implicitním solvatačním modelem COSMO na SQM úrovni pro celý systém. Druhé...
|
host ::
RSS.