|
|
HPLC stanovení gallové kyseliny jako možného produktu enzymatické reakce šikimové kyseliny, NADP+ a šikimátdehydrogenasy.
Smolejová, Jana ; Červený, Václav (vedoucí práce) ; Nesměrák, Karel (oponent)
Tato diplomová práce se zabývá vývojem HPLC metody pro stanovení vybraných chemických látek účastnících se enzymatické reakce, při níž vzniká gallová kyselina. Jedná se o separaci složek reakční směsi, kde výchozími látkami reakce jsou šikimová kyselina, NADP+ , enzym šikimátdehydrogenasa (SDH) extrahovaný z petržele a předpokládaným (hledaným) produktem je gallová kyselina. Byly vyvinuty dvě metody stanovení pomocí běžně používané kolony s chemicky vázaným oktadecylem na silikagelu a kolony Hypercarb s porézním grafitovým uhlíkem. Pro obě stanovení byla použita UV detekce. Separace pomocí kolony C18 je vhodná zejména pro kvantifikaci výsledku reakce. Z důvodu překryvu píků šikimové kyseliny a NADP+ je však nutné sledovat současně absorbanci při 212 i 260 nm. Obě látky lze stanovit přepočtem z kalibrací na základě toho, že šikimová kyselina neabsorbuje při 260 nm, zatímco NADP+ absorbuje při obou. Separace pomocí kolony Hypercarb je vhodná pro studium průběhu reakce, neboť jsou na chromatogramech vidět další produkty, popř. meziprodukty. Stanovení pomocí této kolony se vyznačuje vyšší citlivostí a nižšími limity detekce. Z měření reakčních směsí vyplývá, že pro analýzu kolonou C18 je nejvhodnější složení reakční směsi z TRIS-HCl (tris(hydroxymethyl)aminomethan hydrochlorid) pufru o pH 9, 1·10−2 mol...
|
host ::
RSS.