|
|
The role of nociceptive synaptic transmission modulation at the spinal cord level in different pain states
Adámek, Pavel ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Vaculín, Šimon (oponent) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
Bolest je běžným příznakem mnoha klinických syndromů a nemocí. Zejména léčba bolestí neuropatického původu představuje závažný medicínský problém, neboť dostupná analgesie je v řadě případů neúčinná, nebo má výrazné nežádoucí účinky. Vývoj nových analgetických postupů a úspěšná léčba bolesti proto vyžaduje podrobnou znalost mechanizmů vzniku akutních i chronických bolestivých stavů. Proces vzniku, kódování a přenosu signálů o bolestivých podnětech zprostředkovává nociceptivní systém, který je klíčový pro vznik vjemu bolesti v mozku. Modulace nociceptivního synaptického přenosu v zadním rohu míšním představuje důležitý mechanismus ve vývoji a udržování různých patologických stavů bolesti. Tato disertační práce se zaměřila na zkoumání a objasnění některých mechanismů podílejících se na zpracování a modulaci míšního nociceptivního synaptického přenosu u různých modelů bolestivých stavů. Hlavní pozornost byla věnována studiu následujících otázek: (I.) Jakou úlohu mají TRPV1 (Transient Receptor Potential Vanilloid type 1) kanály, TLR4 (Toll-Like Receptor 4) a PI3K (fosfatidylinositol 3-kináza) v rozvoji neuropatické bolesti po podání chemoterapeutika paclitaxel (PAC) v akutním in vitro a subchronickém in vivo myším modelu PAC-indukované periferní neuropatie (PIPN)? (II.) Do jaké míry je ovlivněna míšní...
|
|
| |
|
|
Functional and structural study of thermally activated TRP ion channels: The role evolutionarily conserved motifs in the TRPA1 modulation
Kádková, Anna ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent) ; Obšilová, Veronika (oponent)
Ankyrinový receptor TRPA1 je iontový kanál exprimovaný převážně na primárních aferentních senzorických neuronech, kde působí jako polymodální senzor pro bolestivé a dráždivé podněty. Kromě chemických látek (např. isothiokyanáty, skořicový aldehyd a jeho deriváty, akrolein, menthol) může být aktivován chladem, depolarizací membránového potenciálu nebo vápenatými ionty z intracelulární strany. Iontový kanál TRPA1 je homotetramerem podjednotek, jež jsou topologicky uspořádány do transmembránové oblasti a cytoplazmaticky orientovaných N- a C-konců. Transmembránová oblast je tvořena šesti alfa-helixy propojenými intra- a extracelulárními kličkami. N-konec receptoru se vyznačuje přítomností 16 až 17 ankyrinových repetic (AR), zatímco C-konec je výrazně kratší a má převážně helikální strukturu. Přesná struktura TRPA1 byla částečně rozřešena roku 2015 pomocí kryo-elektronové mikroskopie, avšak funkční úloha jednotlivých oblastí v polymodální aktivaci receptoru není prozatím plně objasněna. Předkládaná disertační práce se zabývá úlohou mezidruhově konzervovaných strukturních a sekvenčních motivů v cytoplazmatických koncích a v S4-S5 oblasti TRPA1 v napěťové a chemické citlivosti receptoru. Pomocí homologního modelování, molekulárně-dynamických simulací, bodové mutageneze a elektrofyziologických technik bylo...
|
|
|
The role of charged residues in the activation and modulation of the TRPA1 ion channel
Zímová, Lucie ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Doležal, Vladimír (oponent) ; Rokyta, Richard (oponent)
Důležitým receptorem pro detekci bolestivých podnětů je iontový kanál TRPA1 exprimovaný na periferních zakončeních nociceptivních neuronů, kde slouží k převodu fyzikálních a chemických signálů z okolí na signalizaci nervové soustavy. Snaha porozumět mechanizmům aktivace TRPA1 na molekulární úrovni je vedená snahou najít vhodné přístupy k léčení chronických bolestivých stavů u člověka. Naše práce se zaměřila na C-koncovou cytoplazmatickou doménu TRPA1 receptoru, kde jsme popsali možné vazebné místo pro vápník, který je nejdůležitějším modulátorem TRPA1. Díky kombinaci homologního modelování a molekulárně dynamických simulací s elektrofyziologickým měřením se nám podařilo navrhnout hypotézu, která vysvětluje molekulární podstatu dědičného bolestivého syndromu způsobeného bodovou mutací TRPA1. K objasnění principu napěťové aktivace tohoto receptoru jsme přispěli popisem aminokyselin na proximálním C-konci a v S4-S5 oblasti transmembránové domény, které se na napěťové aktivaci podílí. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Úloha reaktivních cysteinů v aktivaci lidského TRPA1 iontového kanálu
Synytsya, Viktor ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Zemková, Hana (oponent)
TRPA1 je teplotně citlivý iontový kanál patřící do rodiny TRP (transient receptor potential) receptorů. V primárních senzorických neuronech představuje TRPA1 klíčovou molekulu v transdukční dráze bolestivých podnětů, kde se podílí na detekci pálivých, dráždivých a zánětlivých látek endogenního i exogenního původu. Hlavním mechanismem chemické aktivace TRPA1 je kovalentní modifikace cysteinových a lysinových reziduí elektrofilními látkami. Účinnost agonistů je navíc zvýšena napěťovou citlivostí TRPA1, jež se významně uplatňuje při depolarizaci buněčné membrány. Dosud byla prokázána účast několika N-terminálních cysteinů na aktivaci TRPA1, úloha šesti cysteinů v transmembránové oblasti však dosud nebyla systematicky prozkoumána. Předložená diplomová práce se zaměřuje na funkční úlohu transmembránově lokalizovaných cysteinů v aktivaci lidského TRPA1 receptoru. Z výsledků vyplývá, že cysteinová rezidua nereagují přímo s elektrofilními látkami, čtyři z nich se však specificky uplatňují při napěťové aktivaci a vrátkování iontového kanálu, dvě cysteinová rezidua ovlivňují modulaci TRPA1 vápenatými ionty. Druhá část práce je zaměřená na zjištění topologické blízkosti dvou opačně nabitých reziduí, již dříve vytypovaných pro interakci prostřednictvím solných můstků. Současná substituce těchto reziduí za...
|
|
|
Mechanismy přenosu signálu muskarinovými receptory
Dolejší, Eva ; Doležal, Vladimír (vedoucí práce) ; Kršiak, Miloslav (oponent) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
Muskarinové acetylcholinové receptory (mAChR) patří do rodiny receptorů spřažených s G-proteiny. Existují v pěti podtypech označovaných jako M1 až M5, které se v různém podtypovém zastoupení nacházejí jak v centrálním nervovém systému, tak na periferii. Muskarinové receptory hrají důležitou roli v mnoha specifických fyziologických funkcích. Narušení přenosu přes mAChR se vyskytuje u závažných onemocnění jako jsou Alzheimerova choroba, schizofrenie či Parkinsonova choroba. Provází je úpadek kognitivních funkcí, který významně souvisí s narušením aktivace M1 receptorů v mozku. Vysoký stupeň homologie ortosterického vazebného místa mAChR velice ztěžuje vývoj podtypově selektivních agonistů. Jedním z mála známých je xanomelin, který účinně aktivuje zejména M1 a M4 podtypy. Xanomelin interaguje s mAChR unikátním způsobem, neboť je kromě reverzibilní vazby do ortosterického místa schopen se na receptor vázat neodmyvatelnou vazbou a alostericky ovlivňovat funkci receptoru. Zatím nevíme, co je podstatou funkční selektivity xanomelinu. Ve snaze o objasnění těchto mechanismů jsme studovali okamžité a dlouhodobé účinky xanomelinu na aktivaci muskarinových receptorů. Použili jsme fibroblasty z vaječníků čínského křečka exprimující jednotlivé podtypy mAChR. Buňky obsahující M2 a M4 receptory jsme přechodně...
|
|
|
Úloha variabilních řetězců na rozhraní podjednotek ve formování ATP-vazebné kapsy a funkci P2X4 receptoru
Tvrdoňová, Vendula ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
5 ABSTRAKT Krystalizace P2X4 receptoru (P2X4R) ze zebřičky ("zebra fish", zfP2X4) v uzavřeném a otevřeném stavu odhalila změny v konformacích ektodomény včetně změn v oblasti styčných ploch mezi levou ("left flipper"; LF) a hřbetní ("dorsal fin"; DF) ploutví. Roli těchto struktur ve formování ATP vazebné kapsy a funkci receptoru jsme zkoumali pomocí alaninové skenovací mutageneze úseků LF (D280-N293) a DF (R203-L214) potkaního P2X4R, a s využitím ATP a analogických agonistů 2-(methylthio)adenosin 5'- trifosfátu, adenosin 5'-(γ-thio)trifosfátu, 2'(3'-O-(4-benzoylbenzoyl)adenosin 5'- trifosfátu a α,β-methylenadenosin 5'-trifosfátu. Sníženou citlivost anebo účinnost ATP mělo 15 z 26 vytvořených mutací. Mutace R203A, N204A a N293A byly v podstatě nefunkční, ale jejich funkci bylo možné obnovit ivermektinem, alosterickým modulátorem P2X4R. Mutace I205A, T210A, L214A, P290A, G291A a Y292A měly změněnou odpověď na ATP a na analogické agonisty. Naproti tomu mutace L206A, N208A, D280A, T281A, R282A a H286A nevykazovaly ve srovnání s divokým typem receptoru žádnou změnu v odpovědích na ortosterické agonisty. Tyto pokusy, společně s homologním modelováním ukázaly, že aminokyseliny z první skupiny nacházející se v horní části obou řetězců LF a DF, se podílejí na přesné organizaci ATP-vazebné kapsy a iniciaci převodu...
|
|
|
Funkční úloha cytoplazmatických konců ankyrinového receptoru TRPA1
Vašková, Jana ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Zemková, Hana (oponent)
Receptor TRPA1 je převážně exprimován na primárních aferentních senzorických neuronech, kde může být aktivován širokým spektrem štiplavých a reaktivních sloučenin, jakými jsou například allyl isothiokyanát nebo cinnamaldehyd. Tyto látky aktivují TRPA1 prostřednictvím kovalentní modifikace cysteinů z cytoplazmatické strany, odkud může být kanál zároveň modulován vnitrobuněčnými vápenatými ionty. Významnou roli v těchto procesech hrají aminové (N-) a karboxylové (C-) konce receptoru. Předkládaná diplomová práce přináší nové poznatky o úloze specifických cytoplazmatických domén v aktivaci TRPA1 receptoru, jež byla studována pomocí elektrofyziologických a molekulárně biologických metod. Měřením membránových proudů TRPA1, vyvolaných chemicky, napětím a vápenatými ionty, byla nalezena vysoce konzervovaná serinová a threoninová rezidua v rámci N-koncové ankyrinové domény, jejichž mutacemi byly silně ovlivněny odpovědi kanálu. Zároveň bylo nově zjištěno, že distální karboxylový konec, o němž bylo již dříve známo, že se podílí na regulaci receptoru vápenatými ionty, přispívá k napěťově závislé aktivaci TRPA1 receptoru.
|
|
| |
|
|
Molekulární mechanizmy aktivace a modulace TRPV3 receptoru
Chvojka, Štěpán ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent)
TRPV3 receptor je teplotně citlivý iontový kanál patřící do rodiny TRP (transient receptor potential) vaniloidních receptorů. Tento kanál je exprimován v keratinocytech kůže, kde se společně s receptorem pro epidermální růstový faktor (EGFR) podílí na růstu a morfogenezi chlupů, tvorbě kožní bariéry, detekci teplotních změn, vzniku bolesti a pruritu. TRPV3 je aktivován řadou rostlinných produktů, jako je karvakrol z oregána, tymol z tymiánu nebo eugenol z hřebíčku. Jeho unikátní vlastností je senzitizace, postupné zvyšování proudové odpovědi při opakované aplikaci agonisty, molekulární podstata tohoto děje však není dosud objasněna. Jednou ze zvažovaných možností je přímá fosforylace TRPV3 proteinu prostřednictvím signální dráhy zahrnující EGFR a mitogenem aktivovanou protein kinázu MAPK1/MAPK3 (také zvanou ERK2/ERK1). V předložené diplomové práci jsme pomocí elektrofyziologické techniky patch-clamp zjišťovali, zda senzitizace TRPV3 receptoru exprimovaného v buněčné linii lidských imortalizovaných keratinocytů může být ovlivněna mutacemi na predikovaných konsensuálních místech pro fosforylaci MAPK1/MAPK3. Z osmi testovaných mutantů, ve kterých byl zaměněn treonin nebo serin za kyselinu asparagovou mimikující fosforylaci, jsme určili 6 míst, jejichž mutace ovlivnila alespoň jeden z testovaných...
|
host ::
RSS.