|
|
Komplementace dsbA mutantního kmene Francisella tularensis a analýza potenciálních vazebných partnerů proteinu DsbA
Šenitková, Iva ; Šimůnek, Tomáš (vedoucí práce) ; Červený, Lukáš (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Iva Šenitková Školitel: doc. PharmDr. Tomáš Šimůnek, Ph.D. Školitel - konzultant: RNDr. Petra Špidlová, Ph.D. Název diplomové práce: Komplementace dsbA mutantního kmene Francisella tularensis a analýza potenciálních vazebných partnerů proteinu DsbA Konzervovaný hypotetický lipoprotein FTT1103 je virulenčním faktorem gramnegativní intracelulární bakterie F. tularensis. Tento protein je homologní k proteinům disulfid oxidoreduktázové rodiny DsbA. Proteiny této rodiny katalyzují tvorbu disulfidických vazeb, které jsou nezbytné pro utvoření správné konformace proteinů, pro jejich aktivitu a stabilitu. Cílem práce byla identifikace vazebných partnerů lipoproteinu FTT1103 běžně nazývaného DsbA, jejichž znalost by nám mohla pomoci v hlubším pochopení role lipoproteinu DsbA ve virulenci F. tularensis. Pomocí metod molekulární biologie jsme vytvořili fúzní gen ftt1103 se sekvencí kódující FLAG® kotvu a klonovali ho do plazmidového vektoru replikujícího se ve F. tularensis. Plazmidový vektor jsme elektroporací vnesli do in frame delečního mutanta F. tularensis subsp. holarctica kmen FSC200/∆1103, čímž došlo k jeho komplementaci in trans. Protein DsbA obsahující FLAG® epitop jsme spolu s jeho...
|
|
|
Study of the effect of novel antiretroviral drugs on carnitine transport in the placenta
Marková, Eliška ; Čečková, Martina (vedoucí práce) ; Červený, Lukáš (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Student/ka: Eliška Marková Školitel: doc. PharmDr. Martina Čečková, Ph.D. Název diplomové práce: Hodnocení vlivu vybraných nových antiretrovirálních léčiv na transport karnitinu v placentě Antiretrovirální léčba HIV-pozitivních těhotných žen představuje v současnosti standardní přístup pro omezení přenosu HIV z matky na plod. Přes nezbytnost této terapie je nicméně důležité, znát její bezpečnost a rizika. Pro správný vývoj plodu a funkci placenty je mj. nezbytný optimální přísun L-karnitinu, klíčového faktoru pro oxidaci mastných kyselin, z krve matky do placenty a krevního oběhu plodu. Publikované studie naznačují častější výskyt onemocnění kardiovaskulárního systému a kardiomyopatií u dětí narozených matkám, jímž byla v průběhu těhotenství podávána antiretrovirální terapie. Optimální transport karnitinu do buněk placenty je zajištěn díky přítomnosti funkčního transportního proteinu OCTN2 v apikální mikrovilózní membráně trofoblastu. Cílem této práce bylo vyhodnotit, zda antiretrovirální léčiva ze skupin nenuklesidových inhibitorů reverzní transkriptázy (rilpivirin a efavirenz), inhibitorů proteáz (ritonavir, sachinavir, tipranavir, lopinavir a atazanavir) a inhibitorů integrázy (dolutegravir a...
|
|
|
TRANSPORT OF NSAIDs ACROSS A BLOOD-BRAIN BARRIER IN VITRO MODEL BASED ON CELL LINE PBMEC/C1-2
Nováková, Iveta ; Štaud, František (vedoucí práce) ; Červený, Lukáš (oponent)
Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Kandidát: Mgr. Iveta Nováková Konzultant: Prof. PharmDr. František Štaud, Ph.D. Název rigorózní práce: Transport NSA přes hematoencefalickou bariéru in vitro modelu založeného na buněčné linii PBMEC/C1-2 Hematoencefalická bariéra (HEB) má významnou roli v regulaci transportu látek do centrálního nervového systému (CNS) a opět z něj ven. HEB částečně zabraňuje průchodu látkám škodlivým pro mozek, zčásti reguluje dodávání potřebných látek a také se podílí na odstraňování odpadních látek. Vyváženost těchto regulačních systémů je nezbytná pro správnou funkci CNS, bez které by došlo k narušení homeostázy. Nesteroidní antiflogistika (NSA) jsou velmi dobře známa pro svůj protizánětlivý účinek, pro schopnost snižovat horečku a pro tišení bolesti. Díky jejich každodennímu užívání byly pozorovány určité vedlejší účinky na mozek (ospalost, závratě, nevolnost). To vyvolalo otázku, jak vlastně NSA prostupuji hematoencefalickou bariéru. Monovrstva vytvořená z buněk PBMEC/C1-2 byla použita jako in vitro model hematoencefalické bariéry. Transportní vlastnosti byly zkoumány u následujících NSA látek: celekoxib, diklofenak, ibuprofen, lornoxikam, meloxikam, piroxikam a tenoxikam. Pokusy byly prováděny s použitím...
|
|
|
Zinc induced activation of breast cancer cell lines and the involvement of Map kinase
Králová, Jarmila ; Čečková, Martina (vedoucí práce) ; Červený, Lukáš (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Kandidát: Jarmila Králová Školitel: Dr. Kathryn Taylor, Ph.D., PharmDr. Martina Čečková, Ph.D. Název diplomové práce: Zinkem indukovaná aktivace buněčných linií karcinomu prsu a role MAP kinázy Cílem práce bylo zjistit vliv zinku na různé signální dráhy v buněčných liniích prsního karcinomu MCF7 a TamR. Rozdíly v signálních drahách mezi MCF7 a TamR byly hodnoceny a zvláštním důrazem na roli MAP kinázy, jejíž aktivace je spojovaná s maligními onemocněními. Vliv zinku na různé buněčné kinázy byl zkoumán v časových úsecích 0, 2, 5, 10, 15 a 20 minut inkubace se zinkem. MCF7 buňky transfekované DNA pro přirozený nebo mutantní zinkový trasportér Zip7, tamoxifen rezistentní buňky a tamoxifen rezistentní buňky předinkubované s inhibitorem MAP kinázy (PD) byly analyzovány za použití metod western blottingu a fluorescenční mikroskopie. Výsledky ukazují závislost aktivace MAP kinázy a dalších důležitých onkogenních kináz (jako jsou Lyn, Src a STAT3) na uvolnění zinku do cytoplasmy. MAP kináza je aktivována na začátku signální dráhy a tudíž může aktivovat mnoho důležitých proteinových kináz jako Src Y418 , STAT3 S727 a Lyn Y396 v tamoxifen rezistentních buňkách. Nicméně závislost aktivace AKT Y413 na MAP...
|
|
|
Studium interakcí léčiv s transportéry z rodiny OATP za využití střevních tkáňových řezů
Čečková, Patrícia ; Vokřál, Ivan (vedoucí práce) ; Červený, Lukáš (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka: Patrícia Čečková Školitel: PharmDr. Ivan Vokřál, Ph.D. Název diplomové práce: Studium interakcí léčiv s transportéry z rodiny OATP za využití střevních tkáňových řezů Kľúčovú úlohu v pôsobení perorálne podávaných liečiv predstavuje ich absorpcia črevnou bariérou. Exprimuje celú radu transportérov, mimo iné OATP2B1 a OATP1A2 influxné transportéry, patriace do rodiny SLC. Sú lokalizované na apikálnej membráne enterocytov a umožňujú prúdenie endogénnych a exogénnych látok z lúmen čriev do enterocytu. Ovplyvňujú nielen farmakokinetiku liečiv, ale aj ich bezpečnosť a účinnosť. Predstavujú miesta pôsobenia interakcií liečiv s inými liečivami/zložkami potravy, ktoré môžu viesť ku zmene účinnosti liečiv alebo toxicite. Keďže FDA (Úrad pro kontrolu potravín a liečiv) a EMA (Európska lieková agentúra) nemajú intestinálne OATP transportéry zahrnuté vo svojich smerniciach preklinických štúdií, nie je vypracovaný jednotný model skúmania interakcií. Limitácie bunkových modelov a geneticky modifikovaných organizmov vedú k rozvoju nových metód, akým je napríklad ex vivo metóda ultratenkých intestinálnych rezov (PCIS), ktorá predstavuje tkanivový model reflektujúci skutočnú 3D štruktúru črevnej bariéry. Cieľom...
|
|
|
Testování inhibiční aktivity nových protinádorových léčiv vůči vybraným izoformám cytochromu P450
Kroulíková, Pavla ; Červený, Lukáš (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka: Mgr. Pavla Kroulíková Vedoucí: RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. Název rigorózní práce: Testování inhibiční aktivity nových protinádorových léčiv vůči vybraným izoformám cytochromu P450 Cytochromy P450 (CYP450) jsou důležité biotransformační enzymy, které ovlivňují farmakokinetické chování řady klinicky užívaných léčiv a jsou příčinou mnoha závažných lékových interakcí. Spekuluje se též o jejich roli v mnohočetné lékové resistenci vzhledem k tomu, že některé izoformy CYP450 jsou schopny deaktivovat cytostatika. Cílem této rigorózní práce bylo in vitro testování inhibice vybraných izoforem (CYP3A4, CYP3A5, CYP1A2, CYP2C8, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 a CYP2B6) látkami ze skupiny inhibitorů tyrozinkináz (TKi) - alectinibem, brivanibem, osimertinibem a selumetinibem. Testování proběhlo pomocí komerčně dostupných Vividâ CYP450 Screening kitů. Lidské cytochromy P450 jsou v těchto kitech rekombinantně vloženy do hmyzích mikrozomů. Výhoda této metody spočívá v tom, že při experimentu neprobíhají současně reakce katalyzované jinými enzymy. Princip je založen na přeměně fluorogenního substrátu na fluorescentní produkt pomocí CYP450. Inhibici jsme zjišťovali měřením fluorescence v 15. minutě od zahájení reakce. Jako...
|
|
|
Studium vlivu antiretrovirálních léčiv na transmembránový transport tenofoviru disoproxil fumarátu přes monovrstvu MDCKII-ABCB1 buněk
Repeľová, Beáta ; Červený, Lukáš (vedoucí práce) ; Čečková, Martina (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakológie a toxikológie Študentka: Beáta Repeľová Školiteľ: PharmDr. Lukáš Červený, Ph.D. Názov diplomovej práce: Studium vlivu antiretrovirálních léčiv na transmembránový transport tenofoviru disoproxil fumarátu přes monovrstvu MDCKII - ABCB1 buněk Tenofovir disoproxil fumarát (TDF), esterové proliečivo tenofoviru, sa radí medzi najvyužívanejšie komponenty kombinovanej antiretrovírusovej terapie. Typické je jeho široké uplatnenie a dobrá tolerovateľnosť pacientmi. Medzi faktory obmedzujúce biodostupnosť po orálnom podaní a distribúciu TDF, patrí liekový efluxný transportér P-glykoproteín (P-gp), ktorého je substrátom. Množstvo antiretrovírusových liečiv je známymi substrátmi, či inhibítormi P-gp, z čoho sa dá predpokladať vznik liekových interakcií na úrovni transmembránového transportu. Cieľom tejto práce bolo popísať vplyv súčasne podaných antiretrovírusových látok na transmembránový transport TDF cez monovrstu buniek MDCKII pomocou obojsmerného transportu a koncentračného ekvilibria. Vyhodnotením experimentov sme potvrdili, že TDF je substrátom P-gp. Po celú dobu trvania experimentov sme zaznamenávali vysoké hodnoty efluxného pomeru vyjadrujúceho transmembránový transport TDF cez monovrstvu parentných buniek, čo naznačovalo zapojenie...
|
|
| |
|
|
Příprava rekombinantní cDNA některých lékových transportérů
Svobodová, Iveta ; Štaud, František (vedoucí práce) ; Červený, Lukáš (oponent)
SOUHRN Amplifikovali jsme CDS pro transportér ABCC4, ABCC5. Pro amplifikaci ABCC5 jsme navrhli dva systémy, pouze první systém jsme zaklonovávali. Optimální teplota annealingu byla 64 řC a optimální koncentrace hořčíku byla 2mM. Jako klonovací kit se nám osvědčil až TOPO XL. Do vektoru jsme zaklonovali CDS pro ABCC4, ABCC5. Inzerty jsme štěpili pomocí restrikčních endonukleáz. ABCC4 jsme vyštěpili Spe I a Not I. ABCC5 jsme štěpili pomocí EcoR I a Hind III. Stejnými endonukleázami jsme štěpili i pZeoSV2(-). Poté jsme inzerty zaklonovali do pZeoSV2(-).
|
|
|
Transport nesteroidních antiflogistik přes hematoencefalickou bariéru in vitro
Nováková, Iveta ; Štaud, František (vedoucí práce) ; Červený, Lukáš (oponent)
Přechod substancí mezi krevním řečištěm a centrálním nervovým systémem (CNS) je regulován hematoencefalickou bariérou (HEB). Malé, lipofilní molekuly jako jsou oxid uhličitý, kyslík nebo etanol mohou procházet přes HEB pomocí pasivní, transcelulární difuze. Naproti tomu schopnost paracelulárního přechodu hydrofilních látek je omezena intercelulárními tight junctions. Díky doprovodným transportním systémům je HEB schopna specificky regulovat transport substancí (např. živin) (Ballabh et al., 2004). Nesteroidní antiflogistika (NSAIDs) jsou v dnešní době hojně užívaná po celém světě, ale prozatím je jen málo známo o jejich schopnosti procházet přes HEB. Vyvoláváním nežádoucích účinků v CNS, mezi ně počítaje např. bolesti hlavy, závratě nebo ospalost, NSAIDs vzbudily zájem o bližší prozkoumání jejich transportních mechanizmů (pro naše studie vybrané látky: celekoxib, diklofenak, ibuprofen, lornoxikam, meloxikam, piroxikam a tenoxikam). Studie byly provedeny jak jednotlivé tak skupinové, s použitím jedné nebo více substancí současně. K pokusům byl používán in vitro model hematoencefalické bariéry vytvořený pomocí humánní buněčné linie ECV304. Protože buněčná vrstva byla pokaždé značně variabilní, byly přidávány vnitřní standardy - diazepam a carboxyfluorescein - a ve vztahu k nim byla data průchodnosti...
|
host ::
RSS.