|
| |
|
|
Mechanisms of DNA repair in the moss Physcomitrella patens
Holá, Marcela ; Angelis, Karel (advisor) ; Bříza, Jindřich (referee) ; Fajkus, Jiří (referee)
Over the course of an organism's life, its genome is exposed to endogenous and exogenous chemical, physical and biological agents - genotoxins. These genotoxins alter its basic structural components - sugar residues, phosphodiester bonds, and nitrogenous bases. Organisms have therefore evolved a plethora of different strategies to both repair DNA lesions and maintain genomic stability. These DNA repair pathways are linked with several other cell pathways, including chromatin remodelling, DNA replication, transcription, cell cycle control, apoptosis - programmed cell death (PCD), thereby providing a coordinated cellular response to DNA damage. Biochemical mechanisms of DNA repair are relatively well understood in yeast and mammals, however, far less so in plants. While these repair mechanisms are evolutionary conserved, significant differences still remain. Therefore, further investigation is required. This thesis summarises the introduction of a novel plant model - the moss, Physcomitrella patens (Physcomitrella). As a haploid gametophyte with unique characteristics of high frequency of homologous recombination (HR), and apical growth of filaments, it is an ideal organism to study DNA repair in plants. Previous research on Physcomitrella regarding mechanisms of DNA lesion repair induced by...
|
|
|
Production of biologically active proteins in plants
Šmídková, Markéta ; Angelis, Karel (advisor) ; Bříza, Jindřich (referee) ; Griga, Miroslav (referee)
6. SOUHRN 1) Byly zavedeny tři rostlinné expresní systém umožňující produkci biologicky aktivních proteinů. První využívá dočasné exprese z vektoru dopraveného do buňky Agrobacteriem po infiltraci listů tabáku bakteriální suspenzí. Pomocí tohoto systému jsme schopni vyprodukovat množství rekombinantního proteinu dosahujícího 5% CRP během 3 dnů. Druhý expresní systém využívá suspenzní kultury stabilně transformovaného mechu Physcomitrella patens. Za kontrolovaných podmínek pěstování v bioreaktoru je výtěžek rekombinantního proteinu srovnatelný s výtěžkem z agroinfiltrace. Expresní systém využívající kombinace virové expresní kazety, založené na TRV, a jejího přenosu do rostlinné buňky pomocí Agrobacteria je pro produkční účely vzhledem k nízkým výtěžkům méně vhodný, nežli předchozí dva systémy. 2) Ve všech třech systémech lze produkovat heterologní proteiny, které se svými vlastnostmi neliší od proteinů produkovaných v původním organismu. Pro dosažení požadované aktivity heterologního proteinu produkovaného rostlinou, stejně jako pro dosažení vysokého výtěžku, je nutné provést řadu optimalizací. Významné je zjištění, že v případě virových antigenů (HPV16L1 protein) i jednořetězcových fragmentů protilátek (scFv MEM97) je pro rostlinu výhodnější exprimovat sekvence genů rekombinantních proteinů s vyšším...
|
|
| |
|
|
Mechanisms of DNA repair in the moss Physcomitrella patens
Holá, Marcela ; Angelis, Karel (advisor) ; Bříza, Jindřich (referee) ; Fajkus, Jiří (referee)
Over the course of an organism's life, its genome is exposed to endogenous and exogenous chemical, physical and biological agents - genotoxins. These genotoxins alter its basic structural components - sugar residues, phosphodiester bonds, and nitrogenous bases. Organisms have therefore evolved a plethora of different strategies to both repair DNA lesions and maintain genomic stability. These DNA repair pathways are linked with several other cell pathways, including chromatin remodelling, DNA replication, transcription, cell cycle control, apoptosis - programmed cell death (PCD), thereby providing a coordinated cellular response to DNA damage. Biochemical mechanisms of DNA repair are relatively well understood in yeast and mammals, however, far less so in plants. While these repair mechanisms are evolutionary conserved, significant differences still remain. Therefore, further investigation is required. This thesis summarises the introduction of a novel plant model - the moss, Physcomitrella patens (Physcomitrella). As a haploid gametophyte with unique characteristics of high frequency of homologous recombination (HR), and apical growth of filaments, it is an ideal organism to study DNA repair in plants. Previous research on Physcomitrella regarding mechanisms of DNA lesion repair induced by...
|
|
|
Study of the DNA recombination mechanisms in plants
Kozák, Jaroslav ; Angelis, Karel (advisor) ; Široký, Jiří (referee) ; Říha, Karel (referee)
DNA double-strand break (DSB) is a dangerous type of DNA damage, but it also serves in controlled increase of genetic variability. The two major DSB repair pathways are homologous recombination (HR) using homologous sequences and non- homologous end joining (C-NHEJ). Two model plants Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) and the moss Physcomitrella patens (Physcomitrella) differ in DSB repair strategies. Arabidopsis uses C-NHEJ, however Physcomitrella prefers HR. These plant models are compared on the basis of measurement of DSB and single strand breaks (SSB) repair by comet assay. The half-life of the first rapid phase of the DSB repair is about 5 minutes in both plant species. Although the C-NHEJ is considered as the main DSB repair pathway in Arabidopsis, rapid repair is independent of AtLIG4 and AtKu80, suggesting the existence of the effective backup non-homologous repair pathways (A-NHEJ). In Physcomitrella, the rapid DBS repair dominates in mitotically active cells and is also independent of PpLIG4. Conversely, PpLIG4 is surprisingly involved in the repair of the DNA alkylation damage. An essential DNA ligase of the rapid DSB repair pathway in Arabidopsis is the replication ligase AtLIG1, which is also responsible for the alkylation DNA damage repair, and thus represents a functional homolog of...
|
|
| |
|
|
Production of biologically active proteins in plants
Šmídková, Markéta ; Angelis, Karel (advisor) ; Bříza, Jindřich (referee) ; Griga, Miroslav (referee)
6. SOUHRN 1) Byly zavedeny tři rostlinné expresní systém umožňující produkci biologicky aktivních proteinů. První využívá dočasné exprese z vektoru dopraveného do buňky Agrobacteriem po infiltraci listů tabáku bakteriální suspenzí. Pomocí tohoto systému jsme schopni vyprodukovat množství rekombinantního proteinu dosahujícího 5% CRP během 3 dnů. Druhý expresní systém využívá suspenzní kultury stabilně transformovaného mechu Physcomitrella patens. Za kontrolovaných podmínek pěstování v bioreaktoru je výtěžek rekombinantního proteinu srovnatelný s výtěžkem z agroinfiltrace. Expresní systém využívající kombinace virové expresní kazety, založené na TRV, a jejího přenosu do rostlinné buňky pomocí Agrobacteria je pro produkční účely vzhledem k nízkým výtěžkům méně vhodný, nežli předchozí dva systémy. 2) Ve všech třech systémech lze produkovat heterologní proteiny, které se svými vlastnostmi neliší od proteinů produkovaných v původním organismu. Pro dosažení požadované aktivity heterologního proteinu produkovaného rostlinou, stejně jako pro dosažení vysokého výtěžku, je nutné provést řadu optimalizací. Významné je zjištění, že v případě virových antigenů (HPV16L1 protein) i jednořetězcových fragmentů protilátek (scFv MEM97) je pro rostlinu výhodnější exprimovat sekvence genů rekombinantních proteinů s vyšším...
|
|
|
Advances in the production of antibodies in plants
Angelis, Karel ; Šmídková, Markéta
Plants are the oldest biotechnological production system and as eukaryots have advantage over bacteria to modify expressed proteins. Laboratory model plants like tobacco along with crop plants with established logistics for harvest and storage like potatoes or rice are used for production of desired proteins. Current trend is to replace soil grown plants with liquid cultures of plant cells grown under controlled conditions. In this respect the moss Physcomitrella patens besides ability to grow in liquid culture enables due to efficient homologous recombination to modify posttranslational glycosylation to correspond human. For heterologous expression in plants, recombinant, single-chain molecules composed of only variable VL and VH regions of the original antibody forming binding pocket are constructed and expressed. Recombinant scFv antibodies are then used as a part of therapeutic or diagnostic drugs in oncology.
|
guest ::
