|
Analýza rekombinantních klonů apoptotické nukleázy v systému "leaf factory" při koinfiltraci modifikujícími geny
LOMNICKÁ, Anna
TBN1 je nukleáza s protinádorovou aktivitou. Hlavní cíl této práce bylo zjistit, jak je TBN1 a její modifikované formy stabilní v systému ?leaf factory", který je používaný k její produkci, a zda může být tato produkce zvýšena nebo ovlivněna vybranými ?modifikátory", například supresory silencingu, transkripčními faktory, glykosyltransferázami a kinázami. Rostliny Nicotiana benthamiana byly infiltrovány směsí kmenů Agrobacterium tumefaciens, které nesly rostlinný expresní vektor nukleázy a které byly koinfiltrovány s ?modifikujícími" vektory. Nukleázové a proteinové analýzy odhalily, že nukleáza TBN1 wt a její modifikované varianty jsou v použitém systému ?leaf factory" stabilní. Pokud jde o jejich molekulovou hmotnost, byly zaznamenány jen kvatitativní změny. Experimenty ukázaly, že se aktivita a produkce nukleáz zvýšila při koinfitraci se supresorem silencingu a klesla při koexpresi s vybraným transkripčním faktorem. Glykosyltransferázy a kinázy ovlivnily aktivitu a produkci jen zanedbatelně. Experimenty také odhalily, že modifikované varianty TBN1 mají rozdílnou molekulovou hmotnost, což naznačuje, že jednotlivé N-glykosylační domény mají různou délku cukerného řetězce a vliv na nukleázovou aktivitu. Naše data ukazují, že exprese in planta se zdá být vhodná pro produkci pro studium protinádorové aktivity těchto nukleáz.
|
|
Expression of SANT/HTH Myb mRNA, a plant morphogenesis-regulating transcription factor, changes due to viroid infection
LOMNICKÁ, Anna
Potato spindle tuber viroid (PSTVd) belongs to plant-pathogenic, circular, non-coding RNAs. Its propagation is accompanied by (mis)regulation of host genes and induction of pathogenesis symptoms including changes of leaf morphogenesis depending on the strength of viroid variant. We found strong genotype-dependent suppression of tomato morphogenesis-regulating transcription factor SANT/HTHMyb (SlMyb) due to viroid pathogenesis. Its relative mRNA level was found to be significantly decreased in PSTVd-sensitive tomato (cvs Rutgers and Heinz 1706) due to degradation processes, but increased in PSTVd-tolerant (cv. Harzfeuer). In heterologous system of Nicotiana benthamiana, we observed a SlMyb-associated necrotic effect in agroinfiltrated leaf sectors during ectopic overexpression. Leaf sector necroses were accompanied by activation of nucleolytic enzymes but were suppressed by a strongly pathogenic PSTVd variant. Contrary to that, PSTVd's effect was inhibited by the silencing suppressor p19. It was found that in both, Solanum lycopersicum leaves and N. benthamiana leaf sectors, SlMyb mRNA degradation was significantly stronger in viroid-infected tissues. Necroses induction as well as gene silencing experiments using the SANT/HTH-Myb homologues revealed involvement of this Myb in physiological changes like distortions in flower morphogenesis and growth suppression.
|
|
Dynamika pohybu a umlčování transgenních lokusů HP1 v živých buňkách
Ondřej, Vladan ; Kozubek, Stanislav ; Lukášová, Emilie ; Matula, Pa. ; Matula, Pe. ; Kozubek, Michal
Na živých buňkách byla studována jaderná lokalizace a pohyblivost transgenních lokusů barvených Cy3. Pozorování ukázala výskyt několika kopií transgenů v každém buněčném jádře. Většina kopií byla lokalizována v centrometrickém heterochromatinu definovaném HPlbeta-GFP fúzním proteinem, menšina kopií v euchromatinu. Sledování lokusů prokázalo jejich omezený difúzní pohyb v krátkém časovém rozmezí. Během dlouhodobého sledování HP1beta domén a transgenních lokusů jsme zjistili, že ve většině případů proximita těchto objektů klesá v čase. Změny v pozici HP1 domén byly velmi malé, ale transgenní lokusy vykazovaly pohyb směrem k relevantní HP1 doméně. Naše data podporují myšlenku, že buněčná jádra se skládají z několika oddělených výše organizovaných kompartmentů. Geny se uvnitř těchto kompartmentů přemísťují, což je v konečném důsledku spojeno se změnami jejich exprese.
|
| |
|
A comparison of SH3 domains' tyrosine phosporylation influence on their binding capacity
Tatárová, Zuzana ; Novotný, Marian (vedoucí práce) ; Kuthan, Martin (oponent)
Pochopenie vplyvu fosforylácie na funkčnosť proteínu je veľmi dôležité z hľadiska formovania dynamických biologických procesov akými sú napr. umlčovanie génov, bunkový rast, diferenciácia alebo apoptóza. Táto práca sa zaoberá fosforyláciou proteín-interakčného modulu známeho ako SH3 doména a vplyvom fosforylácie na väzbovosť jej ligandov. SH3 doména je súčasťou veľkého množstva enzýmov zúčastňujúcich sa priamo signálnej transdukcie ako aj adaptorových proteínov bez enzymatickej aktivity. Mnohé štúdie poukazujú na dôležitosť tyrozínových miest SH3 domény v regulačných mechanizmoch proteínov či už použitím nefosforylovateľných a fosfomimikujúcich mutantov alebo dôkazom in vivo fosforylácie. Práca zahŕňa aj bioinformatickú analýzu, ktorá rozširuje spektrum známych fosforylovaných SH3 domén a potvrdzuje konzervovanosť fosforylácie tyrozínových miest proteínov v SH3 doméne.
|
|
Genotypizace izolátů \kur{Giardia intestinalis}
ŠRÁMOVÁ, Eliška
Cílem práce bylo shromáždit izoláty Giardia intestinalis z lidí a dalších savců. Vzorky stolic byly vyšetřeny na přítomnost cyst koncentrační sedimentační metodou. Následně bylo sekvenováno 532 bp části TPI genu po předchozí amplifikaci pomocí nested PCR. Díky experimentálnímu modelu pískomila byly vybrané izoláty převedeny do in vitro kultury.
|
|
Inaktivace ICAM-1 genu metodou oligonukleotidů modifikovaných lysinem
Kocourková, Aneta ; Štaud, František (vedoucí práce) ; Nachtigal, Petr (oponent)
V této studii se projevuje nadějná možnost zvýšení genové exprese konjugací ligandů na antisense oligonukleotidy a siRNA. Při modifikaci se využilo 2'-O-lysylaminohexylové skupiny vázané na uridinovou bazi, která nahradila jednu, dvě až tři baze thyminové. Uvedené záměny a modifikace bazí byly testovány pro zlepšení inhibice proteinové exprese. Efektivita modifikací v inhibici proteinové exprese byla zkoušena na alicaforsenové sekvenci (DNA) a siRNA. Alicaforsen, který se nachází ve třetí fázi klinické studie, je phosphorothioát komplementární k ICAM-1, siRNA, jenž nově prokázala afinitu k ICAM-1, čehož bylo využito při porovnání účinnosti výše zmíněných modifikací a objevení následných možností uplatnění alicaforsen a siRNA v terapii. Poprvé byla pozorována a prokázána down-regulace ICAM-1 na buněčné linii ECV304, která imituje prostředí hematoencefalické bariéry. Nemodifikované/modifikované sekvence oligonukleotidů a siRNA byly transfekovány do ECV304 buněk. Po 24 hodinové transfekci byly buňky rozrušeny chemickou lýzou. Koncentrace získaných proteinů byly stanoveny Bradford analýzou a následná inhibice ICAM-1 byla vyhodnocena western blotem. Hodnoty inhibicí byly standardizovány k odpovídajícímu aktinu a kontrolním buňkám. Vyhodnocení genové exprese proběhlo pomocí denzitometrie autoradiogramů a...
|
|
Použití rostlinných virů pro navození cílených epigenetických změn u Solanum tuberosum a Nicotiana benthamiana
Dušek, Jakub ; Ryšánek, Pavel (vedoucí práce) ; Barbora, Barbora (oponent)
Předkládaná diplomová práce se zabývá navozením cílených epigenetických změn pomocí upraveného X viru bramboru (PVX, Potato virus X). Z rostlin Solanum tuberosum a Nicotiana benthamiana byl pomocí PCR a speciálně navržených primerů izolován gen nesoucí sekvenci PDS. Primery byly navrženy tak, aby byly univerzální pro obě rostliny a Tm teplota byla v rozmezí 5 °C. Na hraničních úsecích PCR produktů byla přidána restrikční místa (XhoI a ClaI) navržena tak, aby po vložení do PVX byla sekvence PDS v AS orientaci. Virový vektor pGR106 byl později vnesen do rostlin za pomoci Agrobacterium tumefaciens. Tím došlo k degradaci cílového transkriptu, vedoucího k umlčení (silence) genu. Jedná se tedy PTGS (posttranscriptional gene silencing). Fenotypovým projevem je částečné vyblednutí zeleného rostlinného pletiva.
Část rostlin se inokulovala v podmínkách in vitro, a proto musela být vypracována nová metodika, umožňující účinnou inokulaci rostlin sterilním virovým inokulem.
|
|
Studium epigenetických regulací HLA genů II. třídy v rámci příbuzenských vztahů.
Chmel, Martin ; Černá, Marie (vedoucí práce) ; Urbanová, Jana (oponent)
Úvod: V současné postgenomické době představuje studium epigenetických regulací jeden z nástrojů pro porozumění funkci genů. Epigenetické regulace mohou přímo řídit časovou a prostorovou aktivitu genů či jejich umlčení. Molekulární podstata těchto regulací spočívá v modifikaci bází DNA, remodelaci chromatinu a RNA interferenci. Zároveň tyto mechanismy vykazují vlastní způsob přenosu dědičné informace do dalších generací nazývaný epigenetikcá dědičnost. V rámci mnoha chorob byla jako příčina prokázána deregulace epigenetické informace určitých genů. Z tohoto důvodu se jeví studium epigenomu HLA genů jako zvláště důležité, neboť tyto geny hrají zásadní roli v regulaci imunitního systému. Cíle: Cílem této práce je vytvořit popis epigenetických modifikací v rámci rodin. Jedná se o analýzu histonových modifikací a metylace DNA v promotorovém úseku genu HLA DQA1. Cílem bylo rovněž srovnat rozdíly v epigenetických modifikacích mezi alelami a také srovnání rozdílů v daných modifikacích mezi generacemi. Získané výsledky budou porovnány s analýzou míry exprese genu HLA DQA1. Metody: Z odebrané periferní krve dárců byly izolovány DNA, RNA a leukocyty. DNA byla použita ke genotypizaci. Další část vzorků DNA byla konvertována bisulfitovou metodou a posléze sekvenována. Ze získaných dat byla provedena analýza...
|
|
Změny proteomu maligních buněk navozené krátkodobým působením valproové kyseliny
Kostrouchová, Markéta ; Mandys, Václav (vedoucí práce)
Nádory jsou klonální onemocnění mnohobuněčných organismů, které vznikají akumulací genetických mutací a postupnou indukcí epigenetických jevů jež mají za následek transkripční útlum tumor supresorových genů a naopak aktivací exprese tumor propagujících genů. Toto umožňuje nádorovým buňkám, v kombinaci se změněnou odpovědí hostitelského organismu, aby překonaly regulační kaskády, které řídí správnou kooperaci buněk v mnohobuněčném organismu. Epigenetická regulace se uskutečňuje na úrovni DNA metylací CpG ostrůvků a na úrovni post-translační modifikace chromatinových proteinů, histonů na prvním místě. Post-translační modifikace histonů zahrnuje fosforylaci, acetylaci, metylaci, biotinylaci, poly(ADP ribosylaci), ubiqvitinaci a sumoylaci. Histonová acetylace je spojena s transkripční aktivací neboli "otevřeností" chromatinu k regulaci transkripčními faktory. Histony jsou acetylované histon acetyltransferásami (HATs, histone acetyltransferases). Histonová acetylace je dynamický proces, který je zvrátitelný histon deacetylásami (HDACs, histone deacetylases), což jsou enzymy odstraňující acetylový zbytek z acetylovaných histonů. Snížená genová exprese navozená nízkou acetylací histonů je součástí nádorově specifického transkripčního profilu, který je charakterizován utlumenou expresí nebo kompletní eliminací...
|
host ::
