|
|
Specific heme interaction modulates the conformational dynamics and function of p53
Sergunin, Artur ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Tumor supresor p53 je jedním z nejvíce studovaných proteinů v souvislosti s rakovinou a mechanismem jejího vzniku. Obecná funkce p53 spočívá v transkripční regulaci celé řady genů, které různými způsoby ovlivňují velké množství buněčných procesů. Nedávné studie odhalily vztah mezi p53 a homeostázou železa v buňce. Konkrétně, bylo ukázáno, že p53 je schopen interagovat s molekulou hemu a tato interakce vede ve výsledku k narušení DNA- vazebných schopností p53 a podporuje jeho proteazomální degradaci. Tato práce se zabývá podrobným popisem vazby molekuly hemu na p53. Za tímto účelem jsme izolovali dvě formy proteinu p53, bez hemu a s navázaným hemem. Zjistili jsme, že se liší konformační dynamika obou forem s tím, že forma s hemem vykazuje vyšší stupeň flexibility. Taktéž jsme potvrdili dřívější práce, že hem reaguje s p53 specificky a této interakce se účastní cysteinový zbytek. Nicméně, bylo zjištěno, že vazba hemu žádným způsobem nenarušuje oligomerní stav p53 a ani jeho přirozenou schopnost vázat zinek. Nakonec jsme ukázali, že p53 s navázaným hemem má značně narušené DNA-vazebné schopnosti v porovnání s p53 bez hemu. Klíčová slova: hem, senzorové proteiny, protein p53, transkripční faktor, vnitřně neu- spořádané proteiny
|
|
|
Příprava a základní charakterizace eukaryotického iniciačního faktoru 2α a jeho hemem regulované kinasy
Ovad, Tomáš ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Stráňava, Martin (oponent)
Hemové senzorové proteiny se podílejí na řadě významných funkcí v prokaryotických i eukaryotických organismech. Příkladem eukaryotického hemového senzorového proteinu je hemem regulovaný inhibitor (HRI), který katalyzuje fosforylaci α-podjednotky eukaryotického iniciačního faktoru 2 (eIF2α). V rámci této bakalářské práce byl nejprve amplifikován plasmid pET-21c(+)/eIF2α a jeho vhodnost pro expresi proteinu eIF2α byla ověřena pomocí dvou nezávislých metod. Následně byly připraveny proteiny HRI a eIF2α rekombinantní expresí v buňkách E. coli BL-21(DE3) transformovaných plasmidem pET-21c(+)/eIF2α, resp. HRI. Oba proteiny byly z buněčných preparátů izolovány a purifikovány pomocí afinitní a gelové permeační chromatografie. Protein eIF2α byl získán v dostatečně vysokém výtěžku (560 μg z 1 l TB média) i čistotě (90 %). Nižšího výtěžku (25 μg z 1 l TB média) i čistoty (20 %) bylo dosaženo v případě proteinu HRI, autenticita získaného preparátu byla nicméně potvrzena spektrofotometrickou charakterizací a ověřením jeho enzymové aktivity. V rámci pilotních experimentů bylo dálo zjištěno, že GTP může nahradit ATP při fosforylaci eIF2α, zatímco UTP a CTP nikoli.
|
host ::
RSS.