|
|
Utilization of protein radical foootprinting for stuctural biology
Polák, Marek ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Junková, Petra (oponent)
(In Czech) Mapování povrchu proteinů je jednou z metod strukturní biologie, které poskytují důležité informace o struktuře, dynamice, funkci a vazebných interakcích proteinů. V této práci jsme se k mapování povrchu proteinů rozhodli využít unikátní přístup, kterým je kombinace hmotnostní spektrometrie s rychlou fotochemickou oxidací proteinů (FPOP, z anglického Fast Photochemical Oxidation of Proteins), která k tomuto účelu využívá reaktivní radikály kyslíku. Konkrétně byla v této práci metoda FPOP využita ke studiu interakce proteinu s DNA a to přesněji komplexu DNA-vázající domény proteinu FOXO4 s oligonukleotidem DAF16. V první fázi projektu byl produkován a purifikován protein, jehož vazba na DNA byla ověřena nativní elektroforézou a nativní hmotnostní spektrometrií. Dále byly optimalizovány podmínky oxidace proteinu, a to jak v přítomnosti DNA, tak samostatně a modifikace proteinu byly analyzovány hmotnostní spektrometrií pomocí přístupů top-down a bottom-up. Přístupem bottom-up byla identifikována a kvantifikována modifikovaná residua, což odhalilo rozdíly v oxidaci jednotlivých aminokyselin v přítomnosti a nepřítomnosti DNA. Aby se předešlo možným artefaktům způsobených analýzou vícenásobně oxidovaného proteinu, byla kromě hmotnostně spektrometrické analýzy standardním přístupem bottom-up...
|
|
|
Utilization of protein radical foootprinting for stuctural biology
Polák, Marek ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Junková, Petra (oponent)
(In Czech) Mapování povrchu proteinů je jednou z metod strukturní biologie, které poskytují důležité informace o struktuře, dynamice, funkci a vazebných interakcích proteinů. V této práci jsme se k mapování povrchu proteinů rozhodli využít unikátní přístup, kterým je kombinace hmotnostní spektrometrie s rychlou fotochemickou oxidací proteinů (FPOP, z anglického Fast Photochemical Oxidation of Proteins), která k tomuto účelu využívá reaktivní radikály kyslíku. Konkrétně byla v této práci metoda FPOP využita ke studiu interakce proteinu s DNA a to přesněji komplexu DNA-vázající domény proteinu FOXO4 s oligonukleotidem DAF16. V první fázi projektu byl produkován a purifikován protein, jehož vazba na DNA byla ověřena nativní elektroforézou a nativní hmotnostní spektrometrií. Dále byly optimalizovány podmínky oxidace proteinu, a to jak v přítomnosti DNA, tak samostatně a modifikace proteinu byly analyzovány hmotnostní spektrometrií pomocí přístupů top-down a bottom-up. Přístupem bottom-up byla identifikována a kvantifikována modifikovaná residua, což odhalilo rozdíly v oxidaci jednotlivých aminokyselin v přítomnosti a nepřítomnosti DNA. Aby se předešlo možným artefaktům způsobených analýzou vícenásobně oxidovaného proteinu, byla kromě hmotnostně spektrometrické analýzy standardním přístupem bottom-up...
|
host ::
RSS.