|
|
Strukturní charakterizace lidské proteinkinasy CaMKK2 a jejích interakcí s vazebnými partnery
Koupilová, Nicola ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
4 Abstrakt Ca2+/kalmodulin-dependentní proteinkinasa kinasa 2 (CaMKK2) patří do rodiny serin/threonin proteinkinas, které se účastní vápníkové signální dráhy. Při zvýšení intracelulární koncentrace vápenatých kationtů dochází k aktivaci kalmodulinu (CaM), který následně aktivuje své vazebné partnery, mezi které patří CaMKII, CaMKIII, CaMKK1 a CaMKK2. CaMKK2 následně aktivuje prostřednictvím fosforylace proteinkinasy CaMKI, CaMKIV a AMP-dependentní kinasu, AMPK. Přirozeně se v buňkách CaMKK2 vyskytuje v autoinhibovaném stavu, který je způsobený sterickým bráněním aktivního místa autoinhibiční doménou. Při vazbě s kalmodulinem dochází k odklonění autoinhibiční domény a tím ke zpřístupnění aktivního místa. Po aktivaci dochází u CaMKK k autofosforylaci a tím ke zvýšení aktivity. Negativní regulace je způsobena fosforylací cAMP-dependentní proteinkinasou A (PKA) a GSK3. Pro CaMKK1 i CaMKK2 byla identifikována místa, která jsou fosforylována PKA. Dvě z nich jsou součástí vazebného motivu pro proteiny 14-3-3. Předchozí studie ukázaly, že protein 14-3-3 udržuje fosforylovanou CaMKK2 v inhibovaném stavu tím, že brání defosforylaci S495, který blokuje vytvoření vazby s kalmodulinem. Nicméně je nejasné, jestli je to jediná úloha proteinu 14-3-3 v regulaci CaMKK2. Hlavním cílem této diplomové práce byla optimalizace...
|
|
|
Studium mechanismů regulace vybraných proteinkinas
Petrvalská, Olívia
Proteiny 14-3-3 skrze vazbu více než 300 vazebných partnerů regulují značné množství biologicky významných dějů, např. apoptosu, buněčný cyklus, přenos signálu či metabolické dráhy. V rámci této disertační práce byla studována úloha proteinů 14-3-3 v regulaci dvou vybraných proteinkinas ASK1 a CaMKK2. Hlavním cílem práce bylo pochopit strukturní podstatu mechanismů, kterými fosforylace a vazba proteinů 14-3-3 regulují aktivitu těchto proteinkinas pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména metod bodové mutagenese, měření enzymové aktivity, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření, chemického zesítění, nukleární magnetické rezonance a fluorescenční spektroskopie. Na základě získaných dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění byl navrhnut model struktury komplexu katalytické domény proteinkinasy ASK1 s proteinem 14-3-3ζ, který ukazál, že tento komplex je v roztoku konformačně heterogenní. Tento strukturní model společně s daty z časově rozlišené fluorescence a nukleární magnetické rezonance částečně vysvětlují inhibiční mechanismus proteinu 14-3-3. Získané výsledky ukázaly, že protein 14-3-3ζ interaguje s katalytickou doménou ASK1 v těsné blízkosti aktivního místa, a proto by tato interakce mohla mít vliv na strukturu nebo...
|
|
|
Studium mechanismů regulace vybraných proteinkinas
Petrvalská, Olívia
Proteiny 14-3-3 skrze vazbu více než 300 vazebných partnerů regulují značné množství biologicky významných dějů, např. apoptosu, buněčný cyklus, přenos signálu či metabolické dráhy. V rámci této disertační práce byla studována úloha proteinů 14-3-3 v regulaci dvou vybraných proteinkinas ASK1 a CaMKK2. Hlavním cílem práce bylo pochopit strukturní podstatu mechanismů, kterými fosforylace a vazba proteinů 14-3-3 regulují aktivitu těchto proteinkinas pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména metod bodové mutagenese, měření enzymové aktivity, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření, chemického zesítění, nukleární magnetické rezonance a fluorescenční spektroskopie. Na základě získaných dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění byl navrhnut model struktury komplexu katalytické domény proteinkinasy ASK1 s proteinem 14-3-3ζ, který ukazál, že tento komplex je v roztoku konformačně heterogenní. Tento strukturní model společně s daty z časově rozlišené fluorescence a nukleární magnetické rezonance částečně vysvětlují inhibiční mechanismus proteinu 14-3-3. Získané výsledky ukázaly, že protein 14-3-3ζ interaguje s katalytickou doménou ASK1 v těsné blízkosti aktivního místa, a proto by tato interakce mohla mít vliv na strukturu nebo...
|
|
|
Studium mechanismů regulace vybraných proteinkinas
Petrvalská, Olívia ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Jiráček, Jiří (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Proteiny 14-3-3 skrze vazbu více než 300 vazebných partnerů regulují značné množství biologicky významných dějů, např. apoptosu, buněčný cyklus, přenos signálu či metabolické dráhy. V rámci této disertační práce byla studována úloha proteinů 14-3-3 v regulaci dvou vybraných proteinkinas ASK1 a CaMKK2. Hlavním cílem práce bylo pochopit strukturní podstatu mechanismů, kterými fosforylace a vazba proteinů 14-3-3 regulují aktivitu těchto proteinkinas pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména metod bodové mutagenese, měření enzymové aktivity, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření, chemického zesítění, nukleární magnetické rezonance a fluorescenční spektroskopie. Na základě získaných dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění byl navrhnut model struktury komplexu katalytické domény proteinkinasy ASK1 s proteinem 14-3-3ζ, který ukazál, že tento komplex je v roztoku konformačně heterogenní. Tento strukturní model společně s daty z časově rozlišené fluorescence a nukleární magnetické rezonance částečně vysvětlují inhibiční mechanismus proteinu 14-3-3. Získané výsledky ukázaly, že protein 14-3-3ζ interaguje s katalytickou doménou ASK1 v těsné blízkosti aktivního místa, a proto by tato interakce mohla mít vliv na strukturu nebo...
|
|
|
Preparation and characterization of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2 (CaMKK2).
Jarosilová, Kateřina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Vondrášek, Jiří (oponent)
Kalmodulinová proteinkinasová kaskáda je signální dráha, která se podílí na buněčné odpovědi na zvýšenou koncentraci vápenatých iontů uvnitř buňky. Ca2+ patří mezi sekundární posly, které zajišťují odpověď na mnoho podnětů. Většina těchto odpovědí začíná navázáním vápenatých iontů na kalmodulin, receptorový protein uvnitř buňky. Vazbou se zvyšuje afinita kalmodulinu k dalším proteinům, které jsou součástí signální kaskády. Jedním z interakčních partnerů kalmodulinu je kalcium/kalmodulin-dependentní proteinkinasa kinasa 2 (CaMKK2). CaMKK2 je serin/treoninová proteinkinasa, která se podílí zejména na regulaci genové exprese, dále také na regulaci energetické rovnováhy. CaMKK2 se skládá z několika funkčních oblastí, z nichž nejprozkoumanější je kinasová doména (její struktura již byla vyřešena díky krystalografickým studiím). Ta se nachází v prostřední části proteinu (přibližně 298 aminokyselinových zbytků) o velikosti 588 aminokyselin. U zbytku proteinu se předpokládá, že je převážně nestrukturovaný a částečně se strukturalizuje až po navázání ligandu. Cílem této práce bylo připravit několik expresních konstruktů lidské CaMKK2. Tyto konstrukty jsou určeny pro strukturní studie a dále také pro studium interakcí a aktivity jednotlivých proteinů. Při navrhování a přípravě expresních konstruktů se...
|
|
|
Studium post translačních modifikací fosducinu
Šimůnek, Jiří ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Alblová, Miroslava (oponent)
Předkládaná diplomová práce se zabývá studiem úlohy posttranslačních modifikací fosducinu na jeho interakci s proteinem 14-3-3 a dále posouzení vlivu tvorby komplexu na tyto modifikace. Fosducin je 33kDa protein nacházející se ve fotoreceptorových buňkách sítnice, ale také v jiných tkáních. Přes mnohé experimenty jsou však jeho fyziologické funkce stále řešeným tématem. Spekuluje se o jeho vlivu při regulaci signální dráhy oční sítnice, krevního tlaku a exprese G-proteinů. Funkce fosducinu je regulována proteinem 14-3-3, jenž hraje roli v mnohých biochemických procesech. Tvorba komplexu mezi proteinem 14-3-3 a fosducinem vyžaduje fosforylaci dvou serinových zbytků v N-terminální doméně molekuly fosducinu. Úloha vazby proteinu 14-3-3 v regulaci funkce fosducinu je ovšem stále nejasná. V rámci této diplomové práce byly exprimovány proteiny 14-3-3ζ∆C a fosducin (s mutací Q52K) a úspěšně purifikovány. Ke studiu vlivu tvorby komplexu na posttranslační modifikace fosducinu bylo využito limitované proteolýzy a defosforylace. Experimenty ukázaly, že tvorba komplexu způsobuje významné zpomalení defosforylace Ser-54 i Ser-73 a proteolytické degradace, což indikuje protektivní funkci vazby proteinu 14-3-3ζ∆C. Úloha obou 14-3-3ζ∆C vazebných motivů obsahujících Ser-54 a Ser-73 pro interakci fosducinu s...
|
|
|
Studium interakce fosducinu s proteinem 14-3-3
Šimůnek, Jiří ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Alblová, Miroslava (oponent)
Tato bakalářská práce se zabývá interakcí proteinu 14-3-3 a fosducinu, které se podílejí na regulaci přenosu signálu v oční sítnici obratlovců. Tento přenos a zároveň i zesílení signálu jsou zprostředkovány G-proteinovou signální dráhou. Přenos signálu v závislosti na intenzitě světla je regulován dalšími proteiny včetně fosducinu. Fosducin je 33kDa protein, který je exprimován v mnoha tkáních, především ve fotoreceptorových buňkách oční sítnice. Jeho regulační funkce spočívá v inhibici funkce G-proteinu (transducinu). Při přenosu signálu je nutný rozpad transducinu Gtαβγ na podjednotku α (Gtα) a komplex βγ (Gtβγ). Pro opětovnou funkci je nutná reasociace heterotrimeru Gtαβγ, čemuž zabraňuje fosducin, a to vazbou na komplex Gtβγ. Nepřítomnost kompletního transducinu má za následek přerušení signální dráhy a snížení přenosu signálu. Při slabém osvětlení je nutné přenášený signál zesílit, a proto je v sítnici adaptované na tmu fosducin fosforylován, což rozruší jeho vazbu s Gtβγ podjednotkou a obnoví funkci transducinu. Fosforylovaný fosducin je vázán proteinem 14-3-3. Úloha proteinu 14-3-3 v regulaci funkce fosducinu je však stále nejasná. Protein 14-3-3 je 28 kDa protein, který je exprimován ve všech eukaryotických buňkách. Jedná se o protein s rigidní strukturou, který váže a reguluje funkce více...
|
host ::
RSS.