|
|
Parazitární proteáza SmCB2 jako cílová molekula pro léčbu schistosomózy
Bakardjieva, Marina ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Mikeš, Libor (oponent)
Krevničky rodu Schistosoma jsou parazitické motolice, které způsobují schistosomózu, závažné onemocnění postihující více než 240 mil. lidí. Proteolytický systém krevniček je nezbytný pro jejich životaschopnost; účastní se důležitých procesů při interakci s hostitelem, jako je trávení potravy, invaze a migrace tkáněmi. Proto jsou proteázy krevniček perspektivními cílovými molekulami pro terapeutický zásah při léčbě schistosomózy. Tato práce se zabývá proteázou katepsin B2 (SmCB2) z krevničky střevní (S. mansoni), jejíž biochemické vlastnosti a biologická funkce nebyly podrobně studovány. Rekombinantní SmCB2 byl připraven pomocí kvasinkového a bakteriálního expresního systému a chromatograficky purifikován. V aktivitním testu in vitro byly identifikovány první účinné inhibitory SmCB2 blokující jeho proteolytickou aktivitu v submikromolárních koncentracích. Byly připraveny specifické polyklonální protilátky proti SmCB2, které byly použity pro imunomikroskopickou lokalizaci této proteázy v povrchové vrstvě parazita. Pomocí ELISA analýzy bylo zjištěno, že SmCB2 je rozeznáván jako parazitární antigen imunitním systémem hostitele v myším modelu schistosomózy. Práce přináší významné informace o SmCB2 jako potenciální cílové molekule pro syntetické inhibitory a jako novém antigenu pro vakcinační studie.
|
|
|
Cathepsins L of Diplostomum pseudospathaceum cercariae
Perháčová, Terézia ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Hartmann, David (oponent)
Táto štúdia sa zaoberá cysteínovými peptidázami cerkárií motolice Diplostomum pseudospataceum. Naväzuje na doterajší výskum, ktorý u cerkárií biochemicky a hmotnostnou spektrometriou potvrdil prítomnosť cysteínovej peptidázy o veľkosti približne 24 kDa a postuloval jej histolytickú funkciu pri penetrácií tkanív cerkáriami. Pri pokuse o purifikáciu danej peptidázy a charakterizáciu jej peptidolytickej aktivity bolo zistené, že v homogenáte cerkárií sa nachádza viac rôznych cysteínových peptidáz, líšiacich sa ich pI. Podľa peptidolytickej aktivity a testov jej inhibície ide o cathepsin L- like peptidázy, so širokým spektrom pH v ktorom sú aktívne a optimom aktivity pri slabo kyslom až neutálnom pH. Pomocou degenerovaných primerov vytvorených na základe konzervovaných miest cysteínových peptidázbola získaná čiastočná sekvencia troch génov pre katepsíny L D. pseudospathaceum (DpCL1, 2 a 3). Následne boli získané kompletné sekvencie génov DpCL2 a 3 a čiastočná sekvencia bez 5' konca DpCL1 pomocou RACE PCR. Pre potvrdenie funkcie daných peptidáz bol uskutočnený pokus imunolokalizovať ich. Predpoklad bol, že sa nachádzajú v penetračných žľazách. Preliminárne výsledky naznačujú, že by sa niektoré z katepsínov mohli nachádzať tiež v črevách cerkárií. Pre detailnejšiu biochemickú charakterizáciu a...
|
|
|
Proteolytický systém krevniček rodu Schistosoma
Bakardjieva, Marina ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Dvořák, Jan (oponent)
Krevničky rodu Schistosoma jsou parazitické motolice způsobující onemocnění zvané schistosomóza, které postihuje přes 200 milionů lidí v tropech a subtropech. Dospělé krevničky žijí v cévách člověka a živí se krví. Pro růst, vývoj a rozmnožování krevniček jsou zásadní živiny získané degradací hlavního krevního proteinu hemoglobinu. Za jeho trávení zodpovídá proteolytická výbava trávicího traktu kevniček, která je tvořena sadou enzymů z tříd cysteinových a aspartátových proteáz a metaloproteáz, které mají komplementární specifitu. Proteolytické enzymy hrají důležitou roli i při dalších procesech jako je průnik krevniček do hostitele, migrace tkáněmi, překonání imunitního systému a modulace zánětu. Mezi významné proteázy, které se účastní těchto procesů patří enzymy ze třídy serinových a cysteinových proteáz. Vzhledem k tomu, že proteolytický systém je nezbytný pro životaschopnost krevniček, je v současné době předmětem intenzivního výzkumu zaměřeného na vývoj nových vakcín a chemoterapeutik pro léčbu schistosomózy. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Strukturní a funkční analýza katepsinu B1 z krevničky Schistosoma mansoni
Jílková, Adéla ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Mikeš, Libor (oponent)
Schistosomóza je závažné infekční onemocnění postihující více než 200 milionů lidí v oblasti tropů a subtropů. Původcem je parazit krevnička, který žije v cévách člověka a živiny získává degradací hemoglobinu z krve hostitele působením trávicích proteas. V současnosti je k dispozici pouze jediný lék proti schistosomóze a hrozba vzniku rezistence vyvolává potřebu vývoje nových terapeutik. Katepsin B1 (SmCB1) je klíčovou trávicí proteasou krevničky střevní (Schistosoma mansoni) a představuje cílovou molekulu pro terapeutický zásah. Tato práce podává komplexní charakterizaci SmCB1 zaměřenou na vztah struktury a aktivity a na inhibiční regulaci s využitím šesti vyřešených krystalografických struktur molekulárních forem a komplexů SmCB1. SmCB1 je syntetizován ve formě neaktivního zymogenu, ve kterém N-koncový propeptid působí jako přirozený intramolekulární inhibitor blokující aktivní místo. Detailní biochemickou a strukturní analýzou byl identifikován nový unikátní mechanismus procesu aktivace zymogenu, při kterém je propeptid odštěpen, a byla popsána regulace tohoto procesu pomocí glykosaminoglykanů. Studium proteolytické aktivity SmCB1 prokázalo, že se jedná o enzym působící jako endopeptidasa i exopeptidasa a představuje tak účinný nástroj pro trávení hemoglobinu hostitele. Významná část práce se...
|
|
|
Serinová proteasa SmSP2 z krevničky Schistosoma mansoni
Leontovyč, Adrian ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Krevnička Schistosoma mansoni patří k nejvýznamnějším lidským parazitům. Proteolytický systém schistosomy je klíčový pro její interakci s hostitelem, proto se v poslední době staly některé proteasy potenciálním cílem terapeutického zásahu. Tato práce se zabývá dosud nepopsanou serinovou proteasou SmSP2, jejíž biologická funkce je dosud neznámá. Tato proteasa je též zajímavá extrémně vysokým expresním profilem u vývojových stádii parazitujících člověka. V rámci této diplomové práce byla rekombinantní SmSP2 exprimována v prokaryotickém i eukaryotickém expresním systému (E. coli a P. pastoris) a purifikována pomocí chromatografických metod. Byly připraveny polyklonální protilátky proti SmSP2. Byly optimalizovány podmínky pro refolding SmSP2 a byla provedena základní biochemická charakterizace. Substrátová preference pro jednotlivé aminokyseliny v P1 - P4 pozicích byla určena pomocí kombinatoriální knihovny syntetických fluorogenních peptidů (PS-SCL).
|
|
|
Příprava rekombinantního kathepsinu C z krevničky střevní
Illichová, Hana ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
Krevničky rodu Schistosoma způsobují závažné parazitární onemocnění schistosomózu v oblastech tropů a subtropů. Kathepsin C (EC 3.4.14.1) je trávicí cysteinová proteasa krevniček, která se svou dipeptidylaminopeptidasovou aktivitou účastní degradace hemoglobinu z krve hostitele. Tento enzym je pro metabolismus krevniček nezbytný a představuje potenciální molekulární cíl pro vývoj chemoterapeutik pro léčbu schistosomózy. Kathepsin C krevniček nebyl dosud detailně studován a bakalářská práce se soustředí na vývoj expresních systémů pro produkci rekombinantního kathepsinu C ze Schistosoma mansoni (SmCC). V kvasinkách Pichia pastoris byl SmCC exprimován ve formě inaktivního prekurzoru (zymogenu) a byla analyzována jeho proteolytická stabilita. Dále byl připraven expresní systém v prvokovi Leishmania tarentolae, pro který byly navrženy čtyři odlišné konstrukty umožňující optimalizovat produkci SmCC.
|
|
|
Úloha mitochondriálních proteáz v biogenezi mitochondrií
Krump, Ondřej ; Stibůrek, Lukáš (vedoucí práce) ; Pecina, Petr (oponent)
Mitochondrie jsou organely endosymbiotického původu vykonávající v buňce řadu funkcí, od bioenergetiky, přes biosyntézu až po účast na apoptóze. Pro správné fungování mitochondrie v buňce je zásadní regulovaný obrat proteinů v organele, který je pod kontrolou proteolytického systému buňky, zejména pak jeho mitochondriální části. Tento mitochondriální proteolytický systém sestává z několika skupin proteáz. Nejlépe charakterizované AAA+ proteázy tvoří duté oligomery prstencovitého tvaru, uvnitř kterých se nachází proteolytické domény. Přístup substrátu k těmto doménám je závislý na unfoldingu, energeticky náročném ději poháněném hydrolýzou ATP, zprostředkovanou ATPázovými doménami AAA+ proteázy. Hlavní funkcí AAA proteáz je proteolytická degradace proteinů, součást systému kontroly kvality mitochondriálních proteinů. AAA+ proteázy se nachází volně v matrix (Lon a ClpXP), nebo jsou ukotvené ve vnitřní membráně mitochondrií (i-AAA, m-AAA). Procesující peptidázy odštěpují sekvence cílící jaderně kódované mitochondriální proteiny do mitochondrií. Oligopeptidázy štěpí peptidy vzniklé procesujícím i degradativním štěpením na jednotlivé aminokyseliny. Nesprávné fungování různých komponent mitochondriálního proteolytického systému se podílí na řadě onemocnění, zejména na některých formách dědičné spastické paraplegie...
|
|
|
Cathepsin L by parasites - occurrence, features, functions
Perháčová, Terézia ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Kašný, Martin (oponent)
Katepsíny L sú lyzozomálne cysteínové endopeptidázy so všeobecnou funkciou katabolizmu proteínov. Táto práca pojednáva o doterajších poznatkoch o vlastnostiach katepsínov L, v korelácií s ich špecifickými funkciami u parazitov. Detailnejšie popisované sú črty a funkčné rozdiely vybraných katepsínov L s ich objasnením na molekulárnej úrovni. Dôraz kladie na biochemické vlastnosti s následným vyvodením uplatnenia týchto enzýmov. Jednotlivé kapitoly sú venované kinetoplastidovým katepsínom L, katepsínom L apikomplex, entaméb a helmintov, ktorá je prevažne venovaná katepsínom Fasciola spp a Schistosoma spp. Kľúčové slová hydroláza, proteáza, cysteínová peptidáza, cathepsin L, katepsín L, lyzozóm, parazit
|
|
|
Katepsin C z krevničky Schistosoma mansoni
Oupicová, Irena ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Krevničky rodu Schistosoma způsobují schistosomosu, jedno z nejzávažnějších parazitárních onemocnění. Kathepsin C (EC 3.4.14.1), trávicí enzym krevničky, je jedním z potenciálních cílů terapeutického zásahu. Tato cysteinová proteasa nebyla dosud detailně studována. V bakalářské práci byla detekována aktivita kathepsinu C v extraktu z dospělé krevničky střevní (S. mansoni) a krevničky jaterní (S. japonicum). Byla určena inhibiční specifita těchto enzymů s využitím sady selektivních inhibitorů savčích kathepsinů. Kathepsiny C byly vizualizovány na elektroforetických gelech pomocí proteomické fluorescenční značky. Dále byl připraven rekombinantní kathepsin C (SmCC) z krevničky střevní (S. mansoni) homologní expresí v kvasince Pichia pastoris.
|
|
|
Stanovení enzymových aktivit v kompostu
Pernicová, Iva ; doc.Mgr.Pavlína Pelcová, Ph.D. (oponent) ; Voběrková, Stanislava (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá stanovením enzymových aktivit v kompostu a posuzuje jejich změny v průběhu kompostování. Změny aktivity jednotlivých enzymů slouží jako ukazatele činnosti mikroorganismů, které se v kompostu nacházejí. V praktické části práce byly stanoveny změny aktivity proteáz, celuláz, lipáz, dehydrogenáz a ureáz během 21 dnů kompostování za laboratorních podmínek. Sledována byla také změna pH. Změny hodnot pH a všech aktivit enzymů kromě ureáz vykazovaly v prvním týdnu stejný trend související s využíváním dostupných substrátů. Změny aktivit klíčových enzymů v kompostu za laboratorních podmínek byly srovnány se změnami aktivit v kompostu za reálných podmínek, což je ukazatelem rozdílného průběhu kompostování za daných podmínek.
|
host ::
RSS.