|
|
Využití kvasinkového isogenního systému pro studium interakcí proteinu IFI16 s DNA
Kratochvilová, Libuše ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá vazbou interferonem gama indukovaného proteinu 16 (IFI16) k sekundárním lokálním strukturám G-kvadruplexu (G4) a jeho mutacím v jednohybridním kvasinkovém systému (Y1H). Protein IFI16 v buňce rozpoznává vlastní a cizorodou nebo poškozenou DNA, podílí se na tvorbě inflamazomu a indukuje expresi interferonu typu I (IFN-I). Rovněž má podíl na regulaci transkripce a restrikci virové infekce. Bylo prokázáno, že protein IFI16 se preferenčně váže ke strukturám G-kvadruplexů a je schopen je touto vazbou stabilizovat. G-kvadruplexy jsou řazeny mezi nekanonické struktury DNA a RNA tvořené sekvencemi bohaté na G. Snadno jsou tvořeny za fyziologických podmínek a nachází se v řadě významných regulačních strukturách genomu jako jsou telomery nebo promotory onkogenů. Jsou také součástí řady virových genomů. To z nich dělá vynikající potenciální cíle při léčbě nádorových a virových onemocnění. V první experimentální části práce byly připraveny nové reportérové kmeny kvasinek S. cerevisiae metodou Delitto Perfetto, které se lišily pouze v sekvenci s potenciálem tvorby G-kvadruplexu, které byly navrženy a analyzovány programem DNA Analyser. Správnost vkládaných sekvencí byla ověřena PCR a Sangerovým sekvenováním a srovnáním s dodanými sekvencemi oligonukleotidů programem Blast. V druhé části práce byly nově připravené kmeny transformovány vektory pro expresi proteinů p53, IFI16 a posuzován vliv vazby IFI16-G4 na expresi reportérového genu ve spojitosti s nádorovým supresorem p53 s využitím luciferázových reportérových testů. Vyhodnocení proběhlo na základě statistické analýzy velikostí účinků získaných po normalizování signálu luminescence na optickou hustotu kultury při vlnové délce 600 nm. Ze získaných výsledků vyplývá, že protein IFI16 má různý vliv na trans-aktivační potenciál nádorového supresoru p53 v závislosti na vazbě k vznikajícím strukturám v blízkosti promotoru genu, a že k úspěšnému vytvoření G-kvadruplexu bylo třeba dosáhnout prahové hodnoty G4Hunteru skóre alespoň 1,591 a zohlednit potenciál dané sekvence formovat úspěšně alespoň 2 G-tetrády.
|
|
|
Využití kvasinkového isogenního systému pro studium interakcí proteinu IFI16 s DNA
Kratochvilová, Libuše ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá vazbou interferonem gama indukovaného proteinu 16 (IFI16) k sekundárním lokálním strukturám G-kvadruplexu (G4) a jeho mutacím v jednohybridním kvasinkovém systému (Y1H). Protein IFI16 v buňce rozpoznává vlastní a cizorodou nebo poškozenou DNA, podílí se na tvorbě inflamazomu a indukuje expresi interferonu typu I (IFN-I). Rovněž má podíl na regulaci transkripce a restrikci virové infekce. Bylo prokázáno, že protein IFI16 se preferenčně váže ke strukturám G-kvadruplexů a je schopen je touto vazbou stabilizovat. G-kvadruplexy jsou řazeny mezi nekanonické struktury DNA a RNA tvořené sekvencemi bohaté na G. Snadno jsou tvořeny za fyziologických podmínek a nachází se v řadě významných regulačních strukturách genomu jako jsou telomery nebo promotory onkogenů. Jsou také součástí řady virových genomů. To z nich dělá vynikající potenciální cíle při léčbě nádorových a virových onemocnění. V první experimentální části práce byly připraveny nové reportérové kmeny kvasinek S. cerevisiae metodou Delitto Perfetto, které se lišily pouze v sekvenci s potenciálem tvorby G-kvadruplexu, které byly navrženy a analyzovány programem DNA Analyser. Správnost vkládaných sekvencí byla ověřena PCR a Sangerovým sekvenováním a srovnáním s dodanými sekvencemi oligonukleotidů programem Blast. V druhé části práce byly nově připravené kmeny transformovány vektory pro expresi proteinů p53, IFI16 a posuzován vliv vazby IFI16-G4 na expresi reportérového genu ve spojitosti s nádorovým supresorem p53 s využitím luciferázových reportérových testů. Vyhodnocení proběhlo na základě statistické analýzy velikostí účinků získaných po normalizování signálu luminescence na optickou hustotu kultury při vlnové délce 600 nm. Ze získaných výsledků vyplývá, že protein IFI16 má různý vliv na trans-aktivační potenciál nádorového supresoru p53 v závislosti na vazbě k vznikajícím strukturám v blízkosti promotoru genu, a že k úspěšnému vytvoření G-kvadruplexu bylo třeba dosáhnout prahové hodnoty G4Hunteru skóre alespoň 1,591 a zohlednit potenciál dané sekvence formovat úspěšně alespoň 2 G-tetrády.
|
host ::
RSS.