|
|
Development and characterization of light-producing deoxyribozymes
Švehlová, Kateřina ; Curtis, Edward Arthur (vedoucí práce) ; Höbartner, Claudia (oponent) ; Renčiuk, Daniel (oponent)
Chemiluminiscenční proteinové enzymy jako je například luciferáza mají mnoho využití jak v aplikovaném tak i základním výzkumu. V této práci jsme využili metody in vitro selekce, abychom identifikovali deoxyribozymy, které katalyzují chemiluminiscenční reakci. Tyto DNA enzymy světlo produkují pomocí defosforylace komerčně dostupného substrátu CDP-Star. Jednu z nejaktivnějších variant, kterou jsme pojmenovali Supernova, jsme dále vylepšili a popsali pomocí kombinace náhodné mutageneze, in vitro reselekce, sekvenování nové generace, komparativní sekvenové analýzy a optimalizace reakčních podmínek. V současnosti Supernova produkuje světlo 6.500-krát účinněji než reakce CDP-Star bez přidaného enzymu a zaujímá nezvyklou strukturu obsahující trojšroubovici DNA. V rámci charakterizace reakčních podmínek Supernovy jsme dále popsali její nároky na pH, koncentraci Supernovy i substrátu a přítomnost iontů či zahušťovacích činidel. V neposlední řadě jsme ukázali, že Supernova může být pomocí racionálního designu přeměněna na alosterický senzor. Předpokládáme, že námi vyvinutý deoxyribozym bude využíván jako signální část v alostericky regulovaných senzorech, které detekují rozmanité ligandy, a doplní tak ostatní metody využívající radioaktivitu, fluorescenci, či změnu barvy.
|
|
|
In vitro selekce aptamerů pro methioninsulfoxid
Jureček, Matěj ; Míšek, Jiří (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Oxidace methioninu na methioninsulfoxid je jednou z důležitých redoxních posttranslačních modifikací proteinů. Tato modifikace může aktivovat i inhibovat funkci celé řady proteinů a je součástí regulačních mechanizmů různých (pato)fyziologických procesů. Pro výzkum dopadů a funkcí oxidace methioninu by bylo užitečné nalezení bioindikátoru pro methioninsulfoxid. Zatím však nebyla pro methioninsulfoxid v rámci proteinů nalezena žádná protilátka, ani žádný její ekvivalent. Tato práce se zabývala hledáním aptameru na bázi ssDNA, specifického svou vazbou na methioninsulfoxid pomocí metody in vitro selekce (SELEX). V rámci diplomové práce byla otestována řada různých podmínek pro in vitro selekci vůči methioninsulfoxidu. Žádné podmínky nevedly k obohacení počáteční knihovny a selektivní aptamer pro methioninsulfoxid se najít nepodařilo. Nelze vyloučit, že aptamer vůči methioninsulfoxidu lze nalézt, nicméně konvenční podmínky in vitro selekce jsou zřejmě nedostatečné pro tento úkol. V rámci kontrolního in vitro selekce byla získána výrazně obohacená ssDNA knihovna vůči sulforodaminu B jako ligandu. Sekvenace klonů z této obohacené knihovny ukázala přítomnost G-bohatých sekvencí, které jsou typické pro aptamery vůči sulforodaminu B, které byly již publikovány.
|
host ::
RSS.