|
|
Targeted editing of the Arabidopsis CYP98A3 gene using the CRISPR/Cas9 method
Šamaj, Matej
Lignin je biopolymer, který plní několik důležitých funkcí včetně usnadnění polárního transportu vody a mechanického zpevnění rostlinného těla. Je nezbytný pro správný růst a vývoj rostlin, ale také pro obranné reakce rostlin. Komplexní biosyntéza ligninu zahrnuje aktivitu mnoha enzymů katalyzujících navazující chemické reakce, které postupně vytvářejí různé prekurzory pro syntézu ligninu. Jeden takový enzym biosyntetické dráhy ligninu, P‐KUMAROYL ŠIKIMÁT 3′‐HYDROXYLÁZA (C3′H), je kódován genem CYP98A3/C3′H a přeměňuje p-kumaroyl šikimát na kafeoyl šikimát. Systémy CRISPR/Cas adaptované z bakterií, kde poskytují adaptivní imunitu, se velmi rychle vyvinuly v jedinečný a výkonný nástroj pro přesnou editaci genů. Technologie CRISPR/Cas9 umožňuje specificky zacílit na požadovaná místa v genomech a následně provést velmi přesnou mutagenezi vybraného genu (genů). Cílem této práce bylo pomocí metody CRISPR/Cas9 provést cílenou editaci genu CYP98A3/C3′H v transformovaných rostlinách Arabidopsis thaliana. Vybrané transformované rostliny byly ověřeny, aby se potvrdila přítomnost úpravy genu zprostředkované CRISPR/Cas9. Ověřená předpokládaná mutantní rostlina T2 generace vykazovala změněné fenotypy listů, listových růžic, stonků a květenství doprovázené nižším ukládáním ligninu, jak bylo zjištěno histochemickým barvením bazickým fuchsinem a mikroskopickými pozorováními.
|
|
|
Volume-regulated anion channels in astrocytes- in vitro and in situ analysis
Harantová, Lenka ; Anděrová, Miroslava (vedoucí práce) ; Vargová, Lýdia (oponent)
Astrocyty musí být schopné udržet si stálý objem navzdory měnící se osmolaritě vnějšího či vnitřního prostředí, aby mohly správně fungovat. V hypotonickém prostředí nasávají vodu a zvětšují svůj objem. Ke snížení objemu na původní hodnotu pak u astrocytů slouží vypouštění intracelulárních anorganických a organických osmoticky aktivních částic, jako jsou například anorganické ionty, excitační aminokyseliny nebo polyoly, což vede k výtoku vody z buňky. Tento proces nazývaný regulační snižování objemu je zajišťován různými iontovými kanály a přenašeči. Relativně nedávno se do centra pozornosti dostaly objemově regulované aniontové kanály (VRAC). VRAC se vyznačují mírnou vnější usměrněností, střední vodivostí, propustností pro anorganické anionty a organické osmolyty a citlivostí k širokospektrým blokátorům aniontových kanálů. Naším cílem bylo pomocí metody terčíkového zámku charakterizovat VRAC v astrocytárních kulturách z neonatálních potkanů Wistar a objasnit, jaký vliv má intracelullární Na+ na aktivitu těchto kanálů. Dále jsme se zabývali charalterizací VRAC in situ v mozkových řezech 10 - 12 denních potkanů a to především v astrocytech v hipokampu. Zvyšování buněčného objemu jsme dosáhli aplikací hypotonického roztoku (250 mOsm). Ukázali jsme, že v souladu s dříve publikovanými daty, astrocytární kultury...
|
|
|
Histologické a histochemické metody při studiu vývoje samčích pohlavních orgánů
VÁVROVÁ, Martina
Předložená práce se věnuje srovnávacímu studiu využitelnosti fixačních činidel a barvících metod pro studium histologie a histochemie samců komárů Culex pipiens s.l. Studie probíhala u samců druhu Culex pipiens quinquefasciatus Say, který je významným přenašečem filariozy. Histologické či histochemické studie struktury celých zadečků nebo vypreparovaných varlat se prováděly na materiálu fixovaném fixačními činidly {--} Carnoy a Boiun, modifikace Dubosque-Brasil. Fixovaná tkáň se zalévala do paraplastu nebo pryskyřice. Histologické řezy se dělaly pomocí automatického mikrotomu Leica a polotenké řezy pomocí ultramikrotomu Reichert. Řezové preparáty se barvily Mayerovým nebo Harrisovým hematoxylinem nebo barvící metodou dle Malloryho. Polotenké řezy z materiálů zalitých do pryskyřice se barvily toluidinovou modří. Fixační činidlo Bouin, modifikace Dubosque-Brasil se ukázalo jako vhodnější než Carnoy a to jak pro přípravu parafinových řezů tak i pro zhotovení polotenkých řezů z tkání zalitých do pryskyřice. Další výhodou této fixáže je, že fixovaná tkáň se v ní dá uchovávat neomezeně dlouhou dobu aniž by došlo k přefixování tkáně jako je tomu v případě fixáže Carnoy. Pro přehledné histologické preparáty je z použitých metod zřejmě nejvhodnější Malloryho barvení, poskytuje lepší orientaci v barvené tkáni díky celé škále barev - růžové až červené barvení buněčných jader, modré zbarvení vaziva a sekretů. V případě barvení samčích pohlavních orgánů se zdají být jednotlivá použitá barvení (Mallory, Harrisův a Mayerův hematoxylin) srovnatelná. Zalévání do pryskyřice ve spojení s barvením toluidinovou modří (též histochemický průkaz pro sacharidy) se ukázalo jako vhodné pro znázornění jemnějších struktur, v samčích pohlavních orgánech byly zřetelně odlišeny jednotlivé vývojové fáze samčích pohlavních buněk.
|
host ::
RSS.