|
|
Analysis of Thick Film Amperometrical Sensors Signal and Its Usage for Measurement and Characterization of Enzymes
Ondruch, Vít ; Kizek, René (oponent) ; Masojídek,, Jiří (oponent) ; Vrba, Radimír (vedoucí práce)
The principle of synchronous detection (SD) has been applied to biosensor measurement. SD principle achieves significant increases in the signal-to-noise ratio, limit of detection and overall measurement robustness. Application of SD in biosensor measurements improves the analysis of the response and avoids the influence of interference/noise produced by stirring, electromagnetic effects and influence of parasitic currents. SD also enables to decompose the signal to stimulation response and phenomena with long time of response and last but not least, to identify second-order phenomena in the signal. Linear statistical model was used to develop software for identification of the stimulation signal in the output current. SD was applied to the response signal of a Photosystem II complex (PSII) biosensor. PSII response to light stimulation follows first order kinetics. The inhibition kinetics of PSII has been studied. Kinetic constants of herbicide binding to PSII depend linearly on herbicide concentration and enable measurement of its concentration at low concentrations.
|
|
|
Charakterizace mutantů huseníčku psbo1 a psbo2
Nykles, Ondřej ; Duchoslav, Miloš (vedoucí práce) ; Hála, Michal (oponent)
Protein PsbO je nezbytný pro fungování elektron-transportního řetězce v tylakoidních membránách vyšších rostlin. Ve většině krytosemenných rostlin, včetně Arabidopsis thaliana, má tento protein dvě izoformy, PsbO1 a PsbO2. Řada autorů se snažila za pomoci mutantních liniích, které postrádájí jednu či druhou izoformu, odhalit podstatu rozdílnosti PsbO1 a PsbO2. Problémem je, že mutanti v izoformách psbO nemají shodné množství celkového PsbO jako má WT. Vytvořili jsme tak rostliny psbo1isoL. Tyto linie obsahují pouze izoformu PsbO2, avšak v množství, jež je srovnatelné s hladinou PsbO ve WT. Výsledky těchto experimentů naznačují, že pokud má psbo1isoL stejnou hladinu PsbO jako WT, nelze u nich pozorovat fenotypový rozdíl. Za běžných podmínek kultivace jsme tak nebyli schopni určit, zda je mezi PsbO1 a PsbO2 funkční rozdíl. V návaznosti na výše zmíněné výsledky bychom také rádi znali podmínky (pokud takové jsou), za kterých se fenotypově odlišují T-DNA inzerční mutanti psbo2 (respektive psbo2cr, připravení metodou CRISPR/Cas9), mající pouze izoformu PsbO1, od WT. Za běžných podmínek totiž nelze na základě fenotypu psbo2 a psbo2cr od WT rozeznat. Z literatury nám byla známa jediná kultivační metoda, kdy autoři byly schopni odlišit psbo2 od WT. Touto metodou byla specifická hydroponická kultivace....
|
|
|
Function of PsbO isoforms
Duchoslav, Miloš ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Špunda, Vladimír (oponent) ; Sobotka, Roman (oponent)
(česká verze) Oxygenní fotosyntéza je zásadní pro většinu forem života na Zemi. Rozklad vody, při kterém se uvolňuje kyslík, je zajišťován fotosystémem II (PSII), pigment-proteinovým komplexem nacházejícím se v tylakoidní membráně chloroplastů. PsbO je jeho nepostradatelná podjednotka, která se váže na transmembránové podjednotky PSII z luminální strany. Hlavní funkcí PsbO je stabilizovat a chránit manganový klastr (Mn4CaO5), na kterém probíhá rozklad vody. Pravděpodobně má však i další, doplňkové funkce. Tyto doplňkové funkce mohou být rozdílné u izoforem proteinu PsbO, což bylo navrženo pro huseníček (Arabidopsis thaliana), který exprimuje dva geny kódující proteinové izoformy PsbO1 a PsbO2. Tato dizertační práce je zaměřena na doplňkové funkce PsbO s důrazem na rozdíly mezi izoformami. Analýzou sekvencí psbO jsme zjistili, že kromě huseníčku exprimuje dva geny psbO i mnoho dalších druhů rostlin. Zajímavé je, že duplikace genu psbO proběhla mnohokrát nezávisle, typicky ve společném předkovi současných čeledí krytosemenných rostlin. Nicméně izoformy PsbO se přesto liší na podobných místech struktury. To naznačuje, že u PsbO mohlo proběhnout paralelně u různých linií podobné rozrůznění funkcí. Biochemická charakterizace PsbO ze zelené řasy Chlamydomonas reinhardtii a dvou izoforem PsbO z bramboru...
|
|
|
Role of PsbO isoforms in Arabidopsis thaliana
Svoboda, Václav ; Duchoslav, Miloš (vedoucí práce) ; Knoppová, Jana (oponent)
Role izoforem PsbO v Arabidopsis thaliana Abstrakt Fotosystém II (PSII) využívá sluneční energii k oxidaci vody a redukci plastochinonu. Oxidace vody probíhá na kyslík vyvíjejícím komplexu (OEC). OEC je stabilizován vnějšími podjednotkami PSII z nichž největší a nejdůležitější je PsbO, mangan-stabilizující protein, který se vyskytuje ve všech dosud známých oxygenních fotosyntetických organizmech. Modelová rostlina Arabidopsis thaliana exprimuje dvě izoformy genu psbO, jmenovitě PsbO1 a PsbO2. Nedávná pozorování mutantů psbo1 a psbo2, kteří postrádají funkční geny psbO1, respektive psbO2, přinesla nové skutečnosti o konkrétních rolích izoforem PsbO při fotosyntéze. PsbO1 je obecně považována za hlavní izoformu umožňující efektivní rozklad vody, zatímco pro PsbO2 byla navržena role v opravných procesech PSII (výměna světlem poškozeného proteinu D1). Tato práce je zaměřena na konkrétní role izoforem PsbO v Arabidopsis při fotosyntéze a zejména se soustředí na odpověď na světelný stres. Pro rozsáhlou biochemickou studii byli použiti mutanti psbo1, psbo2 a wild type Col-0. Naším cílem bylo zjistit jak je ovlivněna celková struktura a složení thylakoidů u mutantů. Dále zjistit jak probíhá odpověď na světelný stres u wild type s ohledem na změny v množství jednotlivých subkompartmentů, změny v subpopulacích...
|
|
|
Proteomická a funkční charakterizace izoforem PsbO
Duchoslav, Miloš ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Hála, Michal (oponent)
PsbO (mangan-stabilizující protein) je jedním z vnějších proteinů fotosystému II vázaných z luminální strany. Nachází se ve všech oxyfototrofních organismech a zajišťuje správnou funkci Mn4CaO5 klastru, kde probíhá fotosyntetický rozklad vody. Tato práce je zaměřena především na PsbO vyšších rostlin a jeho izoformy - jejich evoluci a funkce. Bioinformatickými analýzami jsme zjistili, že většina vyšších rostlin exprimuje právě dvě izoformy psbO. Fylogenetický strom vytvořený ze sekvencí PsbO má neobvyklou topologii. Na jednotlivé vzájemně paralogní izoformy se neštěpí u báze, jak by se dalo očekávat, ale spíše až na koncích jednotlivých větví, na úrovni čeledí či ještě nižších taxonomických jednotek. V práci jsme navrhli a diskutovali několik hypotéz evoluce izoforem PsbO. Součástí práce byla detailní identifikace spotů na gelech z 2D IEF-SDS PAGE tylakoidů bramboru, ve kterých se vyskytuje PsbO. Ve většině spotů jsme identifikovali konkrétní variantu izoformy. Nepodařilo se nám nalézt žádné posttranslační modifikace PsbO. Optimalizovali jsme metodu exprese psbO špenátu v E. coli a následné purifikace, která umožňuje získat velké množství správně sbaleného rekombinantního proteinu. Pomocí CD spektrometrie jsme zjistili, že při změnách pH typických pro lumen tylakoidů při změně osvětlení se mírně mění...
|
|
|
Úloha mangan-stabilizujícího proteinu fotosystému II
Duchoslav, Miloš ; Rothová, Olga (oponent) ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce)
Miloš Duchoslav Úloha mangan-stabilizujícího proteinu fotosystému II Abstrakt Vznik oxygenní fotosyntézy byl jedním z klíčových momentů evoluce života na Zemi. Veškerý molekulární kyslík v atmosféře pravděpodobně vznikl štěpením vody, které probíhá v centru vyvíjejícím kyslík na fotosystému II. Fotosystém II, složitý komplex mnoha proteinů a kofaktorů, jehož struktura je do velké míry fylogeneticky konzervovaná, se nachází v thylakoidních membránách chloroplastů a sinic. Ač je mechanismus fotosyntetického rozkladu vody, probíhajícího na manganovém klastru, intenzivně zkoumán, není do dnešní doby uspokojivě objasněn. Podstatný vliv na stabilizaci manganového klastru a účinnost rozkladu vody mají vnější proteiny fotosystému II nacházející se v luminu thylakoidů. Nejdůležitější z nich je mangan-stabilizující protein (MSP), který je přítomný ve všech známých oxyfototrofních organismech. V literatuře je tomuto proteinu připisováno velké množství úloh - kromě stabilizace manganového klastru například také karbonátdehydratázová aktivita, GTPázová aktivita či regulace výměny poškozeného proteinu D1. Funkce MSP jsou pravděpodobně řízeny změnami v jeho dynamické struktuře. MSP se pravděpodobně podílí na regulaci fotosyntézy za různých vnějších a vnitřních podmínek. Předložená práce shrnuje současné znalosti o...
|
|
|
Analysis of Thick Film Amperometrical Sensors Signal and Its Usage for Measurement and Characterization of Enzymes
Ondruch, Vít ; Kizek, René (oponent) ; Masojídek,, Jiří (oponent) ; Vrba, Radimír (vedoucí práce)
The principle of synchronous detection (SD) has been applied to biosensor measurement. SD principle achieves significant increases in the signal-to-noise ratio, limit of detection and overall measurement robustness. Application of SD in biosensor measurements improves the analysis of the response and avoids the influence of interference/noise produced by stirring, electromagnetic effects and influence of parasitic currents. SD also enables to decompose the signal to stimulation response and phenomena with long time of response and last but not least, to identify second-order phenomena in the signal. Linear statistical model was used to develop software for identification of the stimulation signal in the output current. SD was applied to the response signal of a Photosystem II complex (PSII) biosensor. PSII response to light stimulation follows first order kinetics. The inhibition kinetics of PSII has been studied. Kinetic constants of herbicide binding to PSII depend linearly on herbicide concentration and enable measurement of its concentration at low concentrations.
|
|
|
Teoretické studium fotosystemu II, chlorozomů a flavoproteinu WrbA
PALENČÁR, Peter
Vďaka narastajúcemu výkonu dnešných počítačov je možné študovať relatívne veľké bio-molekulárne systémy pomocou výpočtových metód, akou je aj rozšírená klasická molekulárna dynamika (MD), v časových škálach desiatok nanosekúnd. Faktorom, obmedzujúcim použitie metód MD na štúdium väčšiny fyziologicky relevantných systémov, je nedostatok kvalitných parametrov silového poľa (SP). Všetky tri bio-molekulárne systémy, ktoré boli predmetom štúdia, membránový pigment-proteínový komplex fotosystému II (FSII), chlorozómy zelených baktérií a flavoproteín WrbA, obsahujú molekuly a molekulárne fragmenty, pre ktoré nie sú dostupné parametre SP. Na výpočet nových parametrov SP pre tieto molekuly a fragmenty boli využité metódy kvantovej mechaniky (KM). Po získaní všetkých parametrov SP boli prevádzané MD simulácie. Základom pre všetky tri výpočtové projekty boli predošlé experimentálne práce našej skupiny. Po prvý krát, boli potvrdené a objasnené svetlom-indukované konformačné zmeny v reakčnom centre (RC) FSII a tiež následné zmeny v postavení pigmentov z RC FSII na úrovni jednotlivých molekúl a atómov za pomoci MD simulácií v dĺžke 20 ns. Optické spektrá, ktoré boli počítané na modeloch RC FSII získané z MD simulácií boli v lepšej zhode s experimentom v porovnaní so spektrami počítanými na statických modeloch RC FSII z kryštalických štruktúr. Kombinácia metód klasickej mechaniky, KM a výpočtov optických spektier na FSII je úspešným príkladom z mála podobných štúdií. V rámci druhého projektu, boli pripravené ekvilibrované lamelárne modely chlorozómov, ktoré boli podrobené MD simuláciám v dĺžke 30 ns, s cieľom objasniť kritické štruktúrne parametre. Prezentované modely predstavujú vôbec prvé takéto MD modely v takom rozsahu. Ekvilibrované MD modely flavoproteínu WrbA boli pripravené s využitím novej kryštalickej štruktúry, a budú ďalej využité na teoretické štúdium zamerané na objasnenie navrhnutého ping-pong mechanizmu.
|
|
|
Structural analysis of extrinsic proteins from the oxygen-evolving complex of photosystem II from higher plants
KOHOUTOVÁ, Jaroslava
Život na naší planete závisí hlavně na přítomnosti kyslíku jehož největší producenti jsou zelené rostliny, sinice a řasy. Kyslík je uvolněn z kyslík-vyvíjejícího komplexu fotosystému II v průběhu fotosyntézy a spotřebován organizmy v procese dýchaní. Kyslík- vyvíjející komplex fotosystému II má stejnou funkci u všech fotosyntetizujících organizmech, ale jednotlivé organizmy vykazují odlišnosti ve struktuře a složení vnějších proteinů, ze kterých je univerzální jenom protein PsbO. V současné době je znám u vyšších rostlin jen strukturní model PS II s malým rozlišením a u sinic krystalová struktura PSII. Vnější proteiny vyšších rostlin (PsbP, PsbQ a PsbR) nejsou strukturně podobné vnějším proteinům ze sinic (PsbO, PsbU and PsbV) a proto není možné předpokládat jejích uspořádání na lumenální straně PSII. Přístupné modely se odlišují hlavně ve struktuře kyslík-vyvíjejícího komplexu, která by mohla být objasněna určením vazebních míst jednotlivých vnějších proteinů. Jednou z nezodpovězených otázek je i výskyt strukturních odlišností kyslík-vyvíjejícího komplexu ve fotosyntetických organizmech jako důsledek evoluce nebo adaptace organizmů k jejich okolí. Struktura vnějších proteinů kyslík-vyvíjejícího komplexu, která může pomoci objasnit umístnění a zároveň upřesnit jejich funkci, je stále nekompletní. V této práci jsme se zaměřili na strukturní analýzy, studium interakcí a pravděpodobné umístnění vnějších proteinů PsbP a PsbQ.
|
|
| |
host ::
RSS.