|
|
Role asparagin syntetázy v leukemických buňkách
Šafrhansová, Lucie ; Starková, Júlia (vedoucí práce) ; Čuřík, Nikola (oponent)
Tato diplomová práce se zaměřuje na detekci mutací enzymu asparaginsyntetázy na metabolismus leukemických buněk a roli tohoto enzymu v kontextu chemoterapie založené na podávaní L-asparaginázy. Experimentální část práce je rozdělená do dvou oddělených úseků. S ohledem na chybějící data sekvenace genu asparaginsyntetázy u leukemií, bylo prvním cílem zjistit, jestli v genu leukemický linií nejsou přítomny mutace, které by mohly mít vliv na funkci ASNS a hrát tak roli v rezistenci leukemických buněk vůči terapii ASNázou. Metodou sekvenování nové generace nebyly nedetekovány žádné mutace, které by mohly ovlivnit aktivitu enzymu. V druhé části byl vytvořen model RS4;11 který exprimuje ASNS. Poté byl studován vliv ASNS na glykolýzu citlivost těchto buněk vůči účinkům L-asparaginázy a k depleci asparaginu a glutaminu. Bylo pozorováno, že exprese ASNS zvyšuje úroveň glykolýzy a zvyšuje odolnost těchto buněk vůči depleci asparaginu a glutaminu a jejich rezistenci vůči asparagináze. Klíčová slova: ASNS, asparagin, leukemie, L-asparagináza, chemoterapie, rezistence
|
|
|
Fytoextrakce směsných vzorků farmak z vodných roztoků
Hájková, Eliška ; Smrček, Stanislav (vedoucí práce) ; Soudek, Petr (oponent)
V životním prostředí byla detekována řada kontaminantů, včetně léčiv. Jejich přítomnost v půdě a vodních zdrojích může mít pro jejich neustále se zvyšující koncentraci toxický vliv na necílové organismy. Metoda fytoremediace využívá schopnosti rostlin vychytávat tyto kontaminanty a různými mechanismy je detoxikovat. Cílem této práce byla fytoextrakce ibuprofenu za využití kukuřice seté (Zea mays) z vodných roztoků média. Byla provedena také fytoextrakce ibuprofenu v kombinaci s dextromethorphanem. Kvantitativní množství extrahovaného ibuprofenu bylo detekováno pomocí HPLC s UV detekcí. Ibuprofen byl velmi dobře rostlinami extrahován. V přítomnosti dextromethorphanu byla účinnost fytoextrakce snížena. Účinnost fytoextrakce ibuprofenu byla 0,10 mg na gram čerstvé hmotnosti listu, zatímco za přítomnosti dextromethorphanu byla fytoextrakční účinnost 0,09 mg na gram čerstvé hmotnosti listu. Po fytoextrakci ibuprofenu byla stanovena antioxidační kapacita v listech a kořenech experimentálních rostlin, z nichž nejvyšší hodnoty vykazovaly kořeny rostlin pěstované s ibuprofenem v kombinaci s dextromethorphanem v médiu. V listech a kořenech byl detekován i obsah fenolických látek, kde nejvyšší zastoupení fenolických látek bylo detekováno v kořenech rostlin pěstovaných s oběma léčivy. Metodou dle Bradforda...
|
|
|
Trávicí proteasy termitů
Čermáková, Markéta ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Narozdíl od trávení celulosy nebyla u termitů dosud studována trávicí proteolýza, proto byly v diplomové práci analyzovány proteolytické enzymy trávicího traktu významných termitích škůdců Reticulitermes santonensis a Coptotermes formosanus (čeleď Rhinotermitidae). Pomocí panelu specifických substrátů a inhibitorů byly kvantifikovány a klasifikovány proteasy v jednotlivých kompartmentech střeva. Hlavní proteasy byly identifikovány ve středním střevě jako endogenní serinové proteasy trypsinového typu; v bachoru byly detekovány minoritní cysteinové proteasy, které jsou pravděpodobně produkovány symbiotickými organismy. Hlavní trypsinová proteasa termita R. santonensis (RsSP) byla chromatograficky izolována jako protein o 26 kDa a byla určena její N-koncová sekvence. S využitím selektivních proteasových inhibitorů byla prokázána fyziologická významnost trávicí trypsinové proteasy v testech in vivo s termitem C. formosanus. Na základě analýzy proteas u dalších 12 druhů termitů bylo navrženo obecné schéma trávicí proteolýzy u řádu Isoptera.
|
|
|
Studie fosforylace anorganické pyrofosfatázy Streptococcus pneumoniae
Štechová, Michaela ; Doubravová, Linda (vedoucí práce) ; Svobodová, Jaroslava (oponent)
Lidský patogen Streptococcus pneumoniae kóduje jednu jedinou Ser/Thr proteinkinázu eukaryotického typu nazvanou StkP. StkP reguluje virulenci, kompetenci, rezistenci ke stresům, genovou expresi a hraje roli v regulaci cyklu buněčného dělení. Analýza fosfoproteomových map divokého kmene S. pneumoniae a mutantního kmene stkP ukázala, že StkP fosforyluje několik pravděpodobných substrátů in vivo, včetně Mn-dependentní anorganické pyrofosfatázy PpaC. Prostřednictvím analyzy hmotnostní spektrometrií byla v aktivním místě proteinu identifikována dvě fosforylovaná místa. Pyrofosfatázy jsou esenciální enzymy, které katalyzují hydrolýzu anorganického pyrofosfátu produkovaného během různých biosyntetických reakcí využívajících ATP. Bylo prokázáno, že změny v pyrofosfatázové aktivitě mají velký efekt na buněčný metabolizmus, růst a dělení bakterií. Cílem této práce bylo studium fosforylace anorganické pyrofosfatázy PpaC v S. pneumoniae. Gen ppaC byl klonován, exprimován v E. coli a protein PpaC byl izolován afinitní chromatografií. Fosforylace PpaC prostřednictvím StkP byla testována kinázovou reakcí, ale nepotvrdili jsme, že PpaC je přímým substrátem StkP in vitro. Dále jsme připravili řadu mutantů v genu ppaC. Dvě pravděpodobné fosfoaminokyseliny identifikované hmotnostní spektrometrií jsme vyměnili za neutrální...
|
|
| |
|
| |
|
|
Trávicí proteasy termitů
Čermáková, Markéta ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Narozdíl od trávení celulosy nebyla u termitů dosud studována trávicí proteolýza, proto byly v diplomové práci analyzovány proteolytické enzymy trávicího traktu významných termitích škůdců Reticulitermes santonensis a Coptotermes formosanus (čeleď Rhinotermitidae). Pomocí panelu specifických substrátů a inhibitorů byly kvantifikovány a klasifikovány proteasy v jednotlivých kompartmentech střeva. Hlavní proteasy byly identifikovány ve středním střevě jako endogenní serinové proteasy trypsinového typu; v bachoru byly detekovány minoritní cysteinové proteasy, které jsou pravděpodobně produkovány symbiotickými organismy. Hlavní trypsinová proteasa termita R. santonensis (RsSP) byla chromatograficky izolována jako protein o 26 kDa a byla určena její N-koncová sekvence. S využitím selektivních proteasových inhibitorů byla prokázána fyziologická významnost trávicí trypsinové proteasy v testech in vivo s termitem C. formosanus. Na základě analýzy proteas u dalších 12 druhů termitů bylo navrženo obecné schéma trávicí proteolýzy u řádu Isoptera.
|
|
|
Studie fosforylace anorganické pyrofosfatázy Streptococcus pneumoniae
Štechová, Michaela ; Svobodová, Jaroslava (oponent) ; Doubravová, Linda (vedoucí práce)
Lidský patogen Streptococcus pneumoniae kóduje jednu jedinou Ser/Thr proteinkinázu eukaryotického typu nazvanou StkP. StkP reguluje virulenci, kompetenci, rezistenci ke stresům, genovou expresi a hraje roli v regulaci cyklu buněčného dělení. Analýza fosfoproteomových map divokého kmene S. pneumoniae a mutantního kmene stkP ukázala, že StkP fosforyluje několik pravděpodobných substrátů in vivo, včetně Mn-dependentní anorganické pyrofosfatázy PpaC. Prostřednictvím analyzy hmotnostní spektrometrií byla v aktivním místě proteinu identifikována dvě fosforylovaná místa. Pyrofosfatázy jsou esenciální enzymy, které katalyzují hydrolýzu anorganického pyrofosfátu produkovaného během různých biosyntetických reakcí využívajících ATP. Bylo prokázáno, že změny v pyrofosfatázové aktivitě mají velký efekt na buněčný metabolizmus, růst a dělení bakterií. Cílem této práce bylo studium fosforylace anorganické pyrofosfatázy PpaC v S. pneumoniae. Gen ppaC byl klonován, exprimován v E. coli a protein PpaC byl izolován afinitní chromatografií. Fosforylace PpaC prostřednictvím StkP byla testována kinázovou reakcí, ale nepotvrdili jsme, že PpaC je přímým substrátem StkP in vitro. Dále jsme připravili řadu mutantů v genu ppaC. Dvě pravděpodobné fosfoaminokyseliny identifikované hmotnostní spektrometrií jsme vyměnili za neutrální...
|
|
|
Enzymatic and inhibiting activity in boar epididymal fluid
Davidová, Nina ; Ren, Š. ; Liberda, J. ; Jonáková, Věra ; Maňásková-Postlerová, Pavla
Sperm maturation, represents a key step in the reproduction process. Spermatozoa, particularly the plasma membrane, are exposed to epididymal fluid (EF) components representing the natural environment essential for their post-testicular maturation. Changes in the sperm membrane proteins are influenced by proteolytic and glycosidic enzymes present in the EF. Accordingly, the occurrence of inhibitors in this reproductive organ is very important for the regulation of sperm membrane protein processing. In present study, we monitored protease and glycosidase activities, and inhibitors of metallo- and serine proteinases in boar EF. Additionally, we studied acrosin inhibitor in fluid, spermatozoa and tissue along the epididymis. We chromatographically separated boar EF into several fractions. These fractions were subjected to SDS-electrophoresis and the separated proteins were either studied by zymographic methods or transferred to nitrocellulose membranes for detection of metallo- and serine proteinases and their inhibitors, and acrosin inhibitor by specific antibody, respectively. Acrosin inhibitor was monitored also in the sperm and tissue of the boar epididymis. In boar epididymal fluid, several metallo- and serine proteinases with different molecular masses, and inhibitors of metalloproteinase MMP-9 and acrosin were found. We measured strong activity of mannosidase in this fluid. Using specific antibody, we registered the increasing signal of acrosin inhibitor from caput to cauda epididymis in the spermatozoa, fluid and also tissue. Proteinases and their inhibitors in reproductive fluids may play a significant role in reproduction processes. Especially, acrosin inhibitor in the reproductive tract inactivates prematurely released sperm acrosin and protects spermatozoa and reproductive epithelium against proteolytic degradation. High mannosidase activity in boar EF suggests evident role of mannose structures in the sperm interaction during reproductive events.
|
|
|
Detection of mannosidase in the porcine urogenital tract – study of the sperm releasing from oviductal reservoir
Maňásková, Pavla ; Ren, Š. ; Jelínková, Jitka ; Krejčová, T. ; Liberda, J.
One of the most important steps of reproduction process is the meeting of sperm with oocyte. Binding of sperm with oviductal cells maintains spermatozoa in fertile state. The beginning of sperm capacitation is associated with oocyte ovulation resulting in the sperm release from oviductal reservoir. Hormonal changes after ovulation probably induce distinct oviductal secretion leading to disruption of the sperm protein binding with oviductal saccharide moieties. Another eventuality of the sperm releasing from oviductal reservoir is a change of oviductal environment caused by components of follicular fluid transported with oocyte after ovulation. In the pig, previous studies indicate lectin-type interaction of sperm protein receptors by mannose structures on the surface of oviductal cells. Our study was focused on enzymatic activity of mannosidase and its detection in porcine oviduct (fluid and tissue) and follicular fluid during hormonal cycle. In fluid from follicles in early and late hormonal stages, we measured mannosidase activity by colorimetric methods at physiological and acidic pH. Expression of secreted mannosidase was studied by specific antibody in follicular and oviductal fluids, and oviductal tissues during hormonal cycle. Clearly increased enzymatic activity of secreted mannosidase was found as specific-species in porcine fluid from follicles in late stage of hormonal cycle. On the other hand, detection of secreted mannosidase in follicular fluid as well as in oviductal fluid did not shown any significant differences during hormonal cycle. In oviductal isthmic tissue, we detected decreased protein expression of secreted mannosidase at middle and late follicular phases. These results suggest possible role of follicular mannosidase rather than oviductal one in the sperm releasing from oviductal reservoir in the pig. The additional study of the gene expression of secreted form of mannosidase in oviductal tissue during hormonal cycle should be necessary.
|
host ::
RSS.