|
|
In vivo biotinylace jako nová metoda značení galektinů
Balogová, Soňa ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Galektiny jsou živočišné lektiny s afinitou k terminálním β-galaktosidům. Tyto lektiny jsou charakteristické evolučně konzervovanou doménou rozpoznávající sacharidy (CRD). Galektiny se in vivo účastní mnoha procesů, jako např. buněčné adheze; signalizace; proliferace buněk a kancerogeneze. Lze je využít jako markery u některých typů rakovin a též pro cílenou vazbu terapeutik v diagnostice a terapii rakovinného bujení. Galektiny byly definovány jako proteinová rodina složená z 15 členů (11 z nich známo u lidí). Jsou klasifikovány do tří podskupin, dle své struktury: prototypické; chimerické; tandemové. Galektin-8 patří mezi tandemové galektiny, které jsou tvořeny dvěma různými podjednotkami spojenými peptidovým můstkem; obsahují dvě různé CRD domény, a jsou proto bivalentní. Interakce galektin-glykan jsou založeny na afinitě CRD galektinů ke glykanům obsahujícím terminální β-galaktosid, přičemž tuto afinitu formuluje právě soubor konzervovaných aminokyselin v rámci každého CRD. Tyto interakce je možno zkoumat mnohými metodami, jako např. rentgenová krystalografie; kompetitivní ELISA; interferometrie na biovrstvě. Díky širokému zapojení galektinů do biologických procesů je známa řada metod značení galektinů pro jejich detekci. Nejpoužívanějšími metodami jsou fluorescenční metody a biotinylace...
|
|
|
Role of PML in ribosomal stress
Kremserová, Petra ; Vašicová, Pavla (vedoucí práce) ; Sztacho, Martin (oponent)
PML je zapojen do řady buněčných procesů. Je organizátorem subjaderných struktur zvaných jaderná tělíska PML a asociuje s jadérkem při odpovědi na ribozomální stres tvorbou jadérkových struktur PML (PNAs). Funkce těchto struktur je nejasná a jednou z možností jejího objasnění je identifikace proteinů interagujících s PML v jadérku. Běžně používanou metodou je koimunoprecipitace, bohužel tento přístup nelze u PML použít pro jeho nízkou rozpustnost. Jednou z alternativ pro překonání této překážky je metoda značení interakčních partnerů biotinem. Cílem této práce bylo ověření využitelnosti metody značení biotinem pro identifikaci interakčních partnerů PML v jadérku. Za tímto účelem jsem vytvořila konstrukty kódující PML IV či její mutovanou formu fúzované s GFP a biotin ligázou pro tranzientní a stabilní expresi, a analyzovala jsem jejich schopnost tvořit PML NBs, doxorubicinem indukované PNAs a schopnost biotinylace. Oba tranzientně exprimované fúzní proteiny tvořily PML NBs a jen divoká forma PML IV tvořila PNAs po ovlivnění doxorubicinem. Schopnost biotinylovat byla zachována. V buňkách s deletovaným genem pro PML stabilně exprimujících fúzní proteiny bylo detekováno aberantní množství a kompozice PML NBs a nebyly pozorovány PNAs. Nicméně tento systém byl využit pro optimalizaci solubilizace biotinylovaných...
|
|
|
Role of PML in ribosomal stress
Kremserová, Petra ; Vašicová, Pavla (vedoucí práce) ; Sztacho, Martin (oponent)
PML je zapojen do řady buněčných procesů. Je organizátorem subjaderných struktur zvaných jaderná tělíska PML a asociuje s jadérkem při odpovědi na ribozomální stres tvorbou jadérkových struktur PML (PNAs). Funkce těchto struktur je nejasná a jednou z možností jejího objasnění je identifikace proteinů interagujících s PML v jadérku. Běžně používanou metodou je koimunoprecipitace, bohužel tento přístup nelze u PML použít pro jeho nízkou rozpustnost. Jednou z alternativ pro překonání této překážky je metoda značení interakčních partnerů biotinem. Cílem této práce bylo ověření využitelnosti metody značení biotinem pro identifikaci interakčních partnerů PML v jadérku. Za tímto účelem jsem vytvořila konstrukty kódující PML IV či její mutovanou formu fúzované s GFP a biotin ligázou pro tranzientní a stabilní expresi, a analyzovala jsem jejich schopnost tvořit PML NBs, doxorubicinem indukované PNAs a schopnost biotinylace. Oba tranzientně exprimované fúzní proteiny tvořily PML NBs a jen divoká forma PML IV tvořila PNAs po ovlivnění doxorubicinem. Schopnost biotinylovat byla zachována. V buňkách s deletovaným genem pro PML stabilně exprimujících fúzní proteiny bylo detekováno aberantní množství a kompozice PML NBs a nebyly pozorovány PNAs. Nicméně tento systém byl využit pro optimalizaci solubilizace biotinylovaných...
|
host ::
RSS.