|
|
Studium interakce receptoru NKp46 s adhesinem Epa1
Houserová, Jana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Jednou ze složek nespecifického imunitního dohledu organismu jsou NK buňky (z angl. natural killer cells, přirozeně zabíječské buňky). Úkolem NK buněk je vyvolat apoptosu u cílových buněk (například buněk rakovinných či virově infikovaných). Cílové buňky jsou rozpoznávány pomocí povrchových receptorů. NK buňky mají na svém povrchu aktivační a inhibiční receptory. Mezi aktivační receptory patří receptor přirozené cytotoxicity NKp46. Jedním z několika dosud popsaných ligandů tohoto receptoru je adhesin Epa1 (z angl. epithelial adhesin 1) kvasinky Candida glabrata. Neschopnost těla spustit imunitní odpověď a bránit se kvasinkové infekci způsobuje vážné komplikace u pacientů s hematologickým onemocněním, tzv. invazivní kandidózy. NK buňky se začínají využívat také v rámci imunoterapie nádorů, konkrétně bispecifické fúzní proteiny, které se jednou částí váží na receptor NK buňky a druhou částí na nádorový antigen. Tato práce se zaměřuje na přípravu rekombinantního proteinu NKp46. Pro studium vlivu O-glykosylace na vazbu ligandu byl připraven mutant glykosylačního místa NKp46 T225A. Proteiny byly produkovány stabilně transfekovanými liniemi HEK293S GnTI- a HEK293T. Protein Epa1 byl produkován v expresním systému E. coli a poté purifikován. Schopnost vazby proteinu Epa1 a laktosy byla ověřena pomocí dvou...
|
|
|
Studium interakce receptoru NKp46 s adhesinem Epa1
Houserová, Jana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Jednou ze složek nespecifického imunitního dohledu organismu jsou NK buňky (z angl. natural killer cells, přirozeně zabíječské buňky). Úkolem NK buněk je vyvolat apoptosu u cílových buněk (například buněk rakovinných či virově infikovaných). Cílové buňky jsou rozpoznávány pomocí povrchových receptorů. NK buňky mají na svém povrchu aktivační a inhibiční receptory. Mezi aktivační receptory patří receptor přirozené cytotoxicity NKp46. Jedním z několika dosud popsaných ligandů tohoto receptoru je adhesin Epa1 (z angl. epithelial adhesin 1) kvasinky Candida glabrata. Neschopnost těla spustit imunitní odpověď a bránit se kvasinkové infekci způsobuje vážné komplikace u pacientů s hematologickým onemocněním, tzv. invazivní kandidózy. NK buňky se začínají využívat také v rámci imunoterapie nádorů, konkrétně bispecifické fúzní proteiny, které se jednou částí váží na receptor NK buňky a druhou částí na nádorový antigen. Tato práce se zaměřuje na přípravu rekombinantního proteinu NKp46. Pro studium vlivu O-glykosylace na vazbu ligandu byl připraven mutant glykosylačního místa NKp46 T225A. Proteiny byly produkovány stabilně transfekovanými liniemi HEK293S GnTI- a HEK293T. Protein Epa1 byl produkován v expresním systému E. coli a poté purifikován. Schopnost vazby proteinu Epa1 a laktosy byla ověřena pomocí dvou...
|
|
|
Rekombinantní exprese proteinu NKp46 a jeho ligandu Epa1
Houserová, Jana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
NK buňky (z angl. natural killer cells - "přirozené zabijácké" buňky) jsou buňky nespecifické imunity a hrají důležitou roli v imunitní odpovědi organismu. Tyto buňky jsou schopny spouštět cytotoxické mechanismy při kontaktu s infikovanými, stresovanými či nádorovými buňkami. Spuštění mechanismů závisí na přítomnosti aktivačních a inhibičních ligandů na povrchu buněk. Na povrchu NK buněk jsou aktivační a inhibiční receptory, které po vazbě na příslušné ligandy vysílají signál NK buňce. Jeden z aktivačních receptorů NK buněk je NKp46. Jedná se o receptor ze skupiny NCR (z angl. natural cytotoxicity receptor - receptory přirozené cytotoxicity). Tento receptor má mnoho ligandů a jedním z nich je adhesin Epa1 z kvasinky Candida glabrata. Tato práce se zaměřuje na přípravu plasmidů a produkci extracelulární části receptoru NK buněk NKp46 a jeho ligandu adhesinu Epa1. Interakce receptoru a jeho ligandu bude zkoumána později. Plasmidy obsahující geny NKp46 a Epa1 byly úspěšně připraveny a ověřeny DNA sekvenací. Protein NKp46 byl produkován v eukaryotickém expresním systému buněčné linie HEK293S GnTI- . Byla připravena stabilně transfekovaná linie HEK293S GnTI- buněk a protein NKp46 byl následně extracelulárně sekretován a izolován z kultivačního média pomocí chelatační afinitní chromatografie a následně...
|
|
|
Rekombinantní příprava jaderného antigenu proliferujících buněk (PCNA)
Herynek, Štěpán ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
NK buňky (z anglického natural killer cells) jsou buňky přirozené imunity. Jejich úkolem je rozpoznávat a likvidovat nádorové nebo například viry infikované buňky. K rozpoznání takto postižených buněk slouží NK buňkám řada povrchových receptorů. Tyto receptory mohou být aktivační, které aktivují cytotoxickou odpověď NK buňky vedoucí k vyvolání apoptosy u cílové buňky, nebo inhibiční, které naopak tuto odpověď NK buněk inhibují. Zda dojde k vyvolání cytotoxické odpovědi záleží na obou typech NK receptorů. Receptor NKp44 patří do rodiny imunoglobulinových receptorů a je to jeden z aktivačních receptorů. Svými vlastnostmi je NKp44 velmi ojedinělý. Dalšími aktivačními receptory z rodiny imunoglobulinových receptorů jsou NKp46 a NKp30. V nedávné době byla popsána interakce mezi receptorem NKp44 a jaderným antigenem proliferujících buněk (PCNA) (z anglického proliferating cell nuclear antigen). PCNA je svorkový protein, který hraje klíčovou roli při replikaci a opravách DNA, neboť ukotvuje proteiny replisomu. Tato práce se zaměřuje na produkci proteinu PCNA a její optimalizaci, a na přípravu expresních vektorů pro pozdější produkci NK receptorů NKp44 a NKp46. Interakce tohoto proteinu se zmíněným receptorem bude zkoumána později. Ze stejného důvodu je připravován i expresní vektor pro protein NKp46....
|
host ::
RSS.