|
|
Detekce mutací a intragenových přestaveb v genech BRCA1 a BRCA2 pomocí sekvenování a metody MLPA
PECHOVÁ, Kristýna
Ve své bakalářské práci jsem se zabývala detekcí mutací v BRCA genech a jejich vlivem na vznik karcinomu prsu. Toto téma je v dnešní době velice důležité, protože právě karcinomy prsu jsou nejčastějším nádorovým onemocněním u žen v České republice (Weinberger a Zikán, 2016). V teoretické části jsem se zaměřila na karcinom prsu, především na jeho diagnostiku a následnou léčbu. Dále jsem se věnovala genetickému poradenství a vyšetření, které je pro diagnostiku dědičných forem karcinomů velmi důležité. Uvedla jsem základní informace týkající se BRCA genů a jejich bílkovinných produktů a shrnula jsem problematiku mutací v těchto genech a jejich souvislost s nádorovým onemocněním, zejména prsu a ovária. V praktické části jsem se věnovala vyšetření vybraných oblastí BRCA genů metodou Sangerova sekvenování. Dnes se BRCA geny vyšetřují metodou NGS, protože umožňuje prohlédnout všechny exony daného genu najednou, ale toto testování nebylo v mých laboratorních podmínkách možné provést, proto jsem zvolila metodu Sangerova sekvenování, která má však určitá kapacitní omezení. Pomocí metody PCR jsem připravila vzorky pro Sangerovo sekvenování, které následně provedla firma Genseq s.r.o. V poslední části své práce jsem zpracovala získané sekvence a provedla vyhodnocení výsledků. Sekvenační metodou jsem nechala vyšetřit celkem 20 anonymizovaných vzorků, z toho byla mutace přítomna u 4 vzorků - jedna byla patogenní, jedna benigní a dvě s nejasným významem.
|
|
|
Molekulárně genetická analýza u Niemann-Pickovy choroby typu C
Marešová, Ivona ; Dvořáková, Lenka (vedoucí práce) ; Hřebíček, Martin (oponent)
Niemann-Pickova choroba typu C je velice závažné onemocnění s autozomálně recesivním typem dědičnosti. Příčinou nemoci jsou patogenní mutace nacházející se v genech NPC1/NPC2. Tyto geny kódují lysozomální neenzymatické NPC1/NPC2 proteiny, které se podílejí na transportu lipidů. V důsledku deficitu těchto proteinů dochází k intracelulárnímu hromadění lipidů, především neesterifikovaného cholesterolu a glykolipidů. Kauzální terapie je v současnosti neuspokojivá, vyvíjejí se proto nové léčebné postupy. Některé z nich závisí na tom, zda se v buňkách pacientů vyskytuje alespoň zbytkové množství transkriptu genu NPC1. U vybraných pacientů, u kterých byla k dispozici kultura kožních fibroblastů, jsem charakterizovala vliv patogenních mutací na množství transkriptu. Výsledky ukázaly, že u všech patogenních mutací je množství transkriptu detekovatelné. Současně jsem charakterizovala strukturu promotoru genu NPC1. Sekvenační analýzou jsem v promotoru nalezla polymorfizmy rs8099071, rs28403610, rs2981422, rs1652354, rs1788774, rs1788772. Analyzovala jsem skladbu polymorfizmů u jednotlivých pacientů, výsledky svědční pro existenci šesti různých haplotypů. U nově diagnostikované pacientky jsem mutační analýzu nalezla pouze jednu patogenní mutaci p.I1061T (c.3182T>C) v genu NPC1. Z tohoto důvodu jsem pomocí...
|
|
|
Frekvence a význam genetických změn v genomu leukemických buněk u dětí s T-ALL
Sládková, Lucie ; Zemanová, Zuzana (vedoucí práce) ; Březinová, Jana (oponent)
T-ALL (T-buněčné akutní lymfoblastické leukemie) představují 10−15 % dětských akutních lymfoblastických leukemií a jedná se o klinicky i geneticky heterogenní onemocnění. Zhruba 50 % nemocných má normální karyotyp, a přestože byla popsána řada kryptických rekurentních chromosomových aberací, jejich prognostický význam není zcela jasný. Cílem studie bylo detailně analyzovat buňky kostní dřeně dětí s T-ALL pomocí cytogenomických metod, určit frekvenci kryptických aberací a posoudit jejich význam pro prognózu onemocnění. Vyšetřili jsme diagnostické vzorky u 67 dětí s T-ALL (19 dívek a 48 chlapců, medián věku 8 let). Získané změny jsme analyzovali metodami G-pruhování, I-FISH (Dako, Abbott) a MLPA (MRC-Holland). Chromosomové aberace jsme detekovali u 60 dětí (91 %). Nejčastějšími změnami byly delece genu CDKN2A (48×), které jsme pozorovali obvykle v kombinaci s dalšími změnami. Dále přestavby lokusů pro TCR geny (20×). Přestavby genu TLX3 jsme detekovali v 18 případech a nikdy nebyly asociovány s přestavbami TCR lokusů. Komplexní karyotyp jsme prokázali u 10 nemocných s rekurentními zlomovými místy 5q35 a 10q24. 47 pacientů žije v první nebo druhé kompletní remisi, relaps onemocnění se vyskytl u 14 dětí a 20 jich zemřelo. Statistická analýza OS i EFS se významně lišila pouze pro parametr TRA/TRD (p =...
|
|
|
Charakteristika chromozomálních změn u nefroblastomů pomocí SNP array a MLPA
Štolová, Lucie ; Vícha, Aleš (vedoucí práce) ; Daňková, Pavlína (oponent)
Nefroblastom je nejrozšířenějším pediatrickým nádorem ledvin, který se vyskytuje především u mladších dětí, s průměrným věkem v době diagnózy 42,5 měsíce u dívek a 36,5 měsíce u chlapců. I přesto, že je jeho léčba v současné době velmi úspěšná a celkové přežívání dosahuje více než 90 %, je stále co nového objevovat a vylepšovat. Důležitou roli pro správný výběr léčby hraje nejenom histologie tumoru, ale také přítomné chromozomální změny. Některé z nich (např. zisk 1q, společná delece 1p a 16q, delece genu TP53) byly potvrzeny jako negativní prognostické markery, jelikož souvisí se zvýšeným rizikem relapsu onemocnění nebo anaplastickým typem nefroblastomu, který je řazen do skupiny vysokého rizika. Tyto změny jsou proto společně s histologií tumoru používány pro stratifikaci nefroblastomů. U některých z těchto změn bylo zjištěno, že se v nefroblastomu nachází i v heterogenním stavu (pouze v části buněk), což také komplikuje léčbu pacienta a není možné na to přijít při odběru pouze jednoho vzorku z tumoru. V práci jsme se zaměřili na detekci chromozomálních změn přítomných v nefroblastomech 44 pacientů a jejich asociacím s klinickými daty. Některé ze známých asociací jsme prokázali (delece 22q s vyšším věkem diagnózy a anaplastickým typem nefroblastomu) a jiné se nám nepodařilo potvrdit (zisk MYCN a...
|
|
|
Molekulární diagnostika deficience lipoproteinové lipásy (LPLD) jako výběr pacientů vhodných pro genovou terapii (AAV1-LPL S447X )
Křížová, Jana
Deficience lipoproteinové lipázy je nedostatečnost enzymu hrajícího klíčovou roli v metabolismu lipoproteinů. Deficience lipoproteinové lipázy může způsobit závažné ataky pankreatitidy. Příčinou deficience enzymu jsou patologické změny v genu LPL. Existuje velké množství variant v genu LPL a také značné množství patogenních variant, jejichž četnost se liší u různých lidských populací. Byla udělená licence první genové terapii v Evropě pro léčbu deficienci lipoproteinové lipázy, využívající hyperfunkční varianty genu LPL. Povedlo se zavést vyšetřovací logaritmus genu LPL zahrnující metody MLPA, Light SNiP, kvantitativní real time PCR a sekvenování za účelem vyhledání pacientů pro tuto terapii. V souboru vzorků DNA převážně od pacientů s historiií pankreatitidy byli vyhledáni 3 pacienti vhodní pro léčbu genovou terapií Alipogene tiparvovec (AAV1-LPL S447X).
|
|
|
Zavedení nových metod pro studium molekulárně genetické podstaty onemocnění CADASIL
Hrubá, Monika ; Vlášková, Hana (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
CADASIL je autozomálně dominantně dědičné neurodegenerativní onemocnění s pozdním nástupem charakterizované poškozením malých cév, podkorovými infarkty a poškozením bílé hmoty mozkové. Nejčastějšími příznaky jsou migrény s aurou, cévní mozkové příhody, zhoršení kognitivních funkcí a demence. Onemocnění je způsobeno mutacemi v genu NOTCH3, převážně jde o jednonukleotidové záměny měnící počet cysteinových zbytků v EGF- like repeticích proteinu Notch3. V České republice se pro analýzu molekulárně genetických příčin tohoto onemocnění užívají metody Sangerova sekvenování PCR produktů a MLPA. U některých pacientů s podezřením na CADASIL se však těmito metodami nepodařilo diagnózu potvrdit. Proto bylo cílem této práce zavést metodu analýzy transkriptu Sangerovým sekvenováním PCR produktů cDNA a metodu kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR) pro zjištění velkých delecí/duplikací. Analýzou transkriptu byla experimentálně potvrzena existence transkripční varianty X1 u zdravých kontrol a bylo prokázáno, že varianta c.1725G>A (p.T575=) má vliv na sestřih. Chybným sestřihem dochází k deleci zahrnující cysteinové zbytky, a tak může tato varianta způsobovat onemocnění CADASIL. U dalších testovaných variant nebyly nalezeny změny na úrovni transkriptu. Metoda qPCR neprokázala při použití v této práci dostatečnou...
|
|
|
Verification of somatic mutations important for neuroectodermal tumors (CTNNB1, BRAF, ALK)
Hrindová, Božidara ; Vícha, Aleš (vedoucí práce) ; Janatová, Markéta (oponent)
Diplomová práca bola zameraná na dôkaz vybraných somatických mutácií u génov ALK (Anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase), BRAF (v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1) a β-katenín (CTNNB1) prostredníctvom molekulárno - genetických metód v cieľovej skupine neuroektodermálnych nádorov (neuroblastóm, meduloblastóm, nádory mozgu, paragangliom a feochromocytóm). Niektoré z nich sú už považované za prognostické ukazovatele, ktoré napomáhajú určiť podtyp jednotlivých malignít a na základe tejto molekulárno - biologickej klasifikácie výber správnej liečby. Pre analýzu bol použitý genetický materiál od 133 pacientov, rozdelený podľa typu nádorového ochorenia. Prítomnosť mutácie bola detegovaná v siedmych prípadoch, z čoho 2 prislúchali génu BRAF, 1 génu ALK a 4 génu β-katenín. U jednotlivých génov boli predmetom skúmania hotspotové mutačné miesta, pričom cieľom bolo potvrdiť prítomnosť mutácií v nich a prispieť tým k štúdiám zameraným na zavedenie vhodnejšej liečby pomocou inhibítorov mutovaných génov. Kľúčové slová: ALK, BRAF, β-katenín (CTNNB1), neuroektodermálne nádory, sekvenácia, MLPA
|
|
|
Molekulárně genetická analýza u Niemann-Pickovy choroby typu C
Marešová, Ivona ; Dvořáková, Lenka (vedoucí práce) ; Hřebíček, Martin (oponent)
Niemann-Pickova choroba typu C je velice závažné onemocnění s autozomálně recesivním typem dědičnosti. Příčinou nemoci jsou patogenní mutace nacházející se v genech NPC1/NPC2. Tyto geny kódují lysozomální neenzymatické NPC1/NPC2 proteiny, které se podílejí na transportu lipidů. V důsledku deficitu těchto proteinů dochází k intracelulárnímu hromadění lipidů, především neesterifikovaného cholesterolu a glykolipidů. Kauzální terapie je v současnosti neuspokojivá, vyvíjejí se proto nové léčebné postupy. Některé z nich závisí na tom, zda se v buňkách pacientů vyskytuje alespoň zbytkové množství transkriptu genu NPC1. U vybraných pacientů, u kterých byla k dispozici kultura kožních fibroblastů, jsem charakterizovala vliv patogenních mutací na množství transkriptu. Výsledky ukázaly, že u všech patogenních mutací je množství transkriptu detekovatelné. Současně jsem charakterizovala strukturu promotoru genu NPC1. Sekvenační analýzou jsem v promotoru nalezla polymorfizmy rs8099071, rs28403610, rs2981422, rs1652354, rs1788774, rs1788772. Analyzovala jsem skladbu polymorfizmů u jednotlivých pacientů, výsledky svědční pro existenci šesti různých haplotypů. U nově diagnostikované pacientky jsem mutační analýzu nalezla pouze jednu patogenní mutaci p.I1061T (c.3182T>C) v genu NPC1. Z tohoto důvodu jsem pomocí...
|
|
|
Použití metody MLPA pro stanovení nebalancovaných změn genomu
KŘÍHOVÁ, Miroslava
Nebalancované přestavby chromosomů nebo-li nevyvážené přestavby jsou změny spojené s přítomností nadbytečného určitého chromosomového úseku, nebo se naopak jedná o jeho absenci. MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoda založená na PCR (Polymerase Chain Reaction) principu, která ale na místo cílových sekvencí amplifikuje MLPA sondy, které se na tyto cílové sekvence hybridizují a následně je při ligaci spojují. Při MLPA je použit pouze jeden pár PCR primerů. V teoretické části se zabývám představením MLPA metody a v krátkosti i dalších metod využívaných v diagnostice lékařské genetiky např. PCR, FISH (Fluorescence in situ hybridization), Array CGH (Comparative genomic hybridization). Taky jsem zde uvedla nemoci, které jsou nebalancovanými přestavbami způsobené a některé z nich i více popsala a to konkrétně mentální retardaci a mutaci genu BRCA1,2 (Breast cancer). Praktickou část jsem prováděla v Laboratoři molekulární biologie a genetiky v Nemocnici České Budějovice a.s. a to konkrétně pod vedením pana Mgr. Ondřeje Scheinosta. Zde jsem se zabývala provedením metody MLPA u konkrétních pacientů, kvůli diagnostice BRCA1,2 genu, mikrodelečních syndromů (mentální retardace) nebo subtelomerických delecí. Vše jsem dělala pod odborným dohledem vedoucího této práce a ostatních pracovníku laboratoře. Všechny postupy byly provedeny podle standartních operačních postupů. V další části této práce se zabývám interpretací výsledků a jejich srovnáním s ostatními dostupnými metodami. A v neposlední řadě se v této části mé práce zabývám rozvahou nad rozdílnými přístupy statistické analýzy v rámci MLPA.
|
host ::
RSS.