|
|
Vliv kultivačního média na identifikaci kvasinek rodu Cryptococcus hmotnostní spektrometrií
Jurnečková, Alena ; Vadkertiová, Renata (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Rod Cryptococcus je v oblasti klinické mikrobiologie znám pro svoji obtížnou identifikaci a taxonomické zařazení. Pro tuto bakalářskou práci bylo vybráno celkem 22 kmenů kvasinek rodu Cryptococcus. Větší část kmenů byla nejprve sekvenována analýzou D1/D2 domény LSU rRNA genu. Pro kultivaci byly zvoleny tři typy médií – YPD, bramborový a Sabouraudův agar. Vzorky byly upraveny dle normované metody firmy Bruker Daltonik, Chemického ústavu SAV a kombinací těchto dvou metod. Identifikace byla provedena metodou hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF. Získaná spektra byla porovnána příslušným softwarem a vyhodnocena na základě specifického algoritmu. Nejvhodnější médium pro kultivaci a tedy biotypizaci s procentuálně nejvyšším skórem bylo YPD (Yeasts pepton dextrose). Naopak nejméně vhodným kultivačním médiem byl Sabouraudův agar (SA), který dosáhl nejmenší procentuální úspěšnosti dle parametrů daných algoritmem firmy Bruker Daltonik. V případě metod úpravy a aplikace vzorku dosáhla nejvyšší úspěšnosti kombinovaná metoda při použití YPD média. Výsledkem kompletní analýzy jsou dendrogramy pro jednotlivá média zobrazující genetickou podobnost kmenů kvasinek. Dendrogram znázorňuje zařazení jednotlivých kmenů do příslušných skupin. Do fylogenetické skupiny Cr. laurentii I (označení větve v dendrogramu A) byly správně zařazeny kmeny Cr. flavescens (CCY 17-3-28, CCY 17-3-30) a Cr. laurentii (CCY 17-3-2). Přestože kmen Cr. flavus (CCY 17-3-5) vykazuje podobnost s kmenem Cr. flavescens, nepatří do této fylogenetické skupiny. Do fylogenetické skupiny Cr. laurentii II (označení větve B) byly umístěny kmeny Cr. carnescens (CCY 17-3-13) a Cr. victoriae (CCY 17-3-26). Kmeny Cr. magnus (CCY 17-4-39, CCY 17-4-40) se vyznačují podobností s těmito kmeny, ale do fylogenetické skupiny II nepatří. Kmeny Cr. gastricus (CCY 17-5-1) a Cr. diffluens (nezařazený) tvoří větev s označením C. Cr. aerius (CCY 17-4-9), který byl také do této skupiny zařazen, jsme navrhli na sekvenční analýzu, neboť jeho spektrum spíše naznačuje, že se jedná o kmen Cr. diffluens. Větev dendrogramu, nesoucí označení D, obsahuje kmeny Bulleromyces albus (CCY 17-3-35, CCY 17-3-36) a Cr. saitoi (CCY 17-3-18, CCY 17-4-2). Sekvenovaný Cr. albidus (CCY 17-4-1), nesekvenovaný Cr. diffluens (CCY 17-4-13) a Cr. terreus (CCY 17-8-1) se řadí do skupiny označenou písmenem E. Vzhledem k tomu, že sekvenovaný kmen Cr. diffluens se vyskytl už ve skupině C, byl kmen CCY 17-4-13 navržen na sekvenční analýzu. Do této skupiny se řadí také sekvenovaný Cr. aerius (CCY 17-25-1), který však tvoří samostatnou větev v dendrogramu v rámci skupiny. Poslední skupinu, označenou písmenem F, tvoří Cr. macerans (CCY 17-19-3) a také kontrolní kmeny Cr. neoformans var. neoformans (CCY 17-1-4, CCY 17-1-5).
|
|
|
Biotypizace askomycetních kvasinek
Jurnečková, Alena ; Dudášová,, Hana (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Pro biotypizaci MALDI-TOF bylo vybráno celkem 84 izolátů kvasinek například z vody, rostlin, ovocných plodů nebo půdy. Veškeré kmeny byly kultivovány na sladinovém agaru a YPD médiu. Vzorky pro biotypizaci byly upraveny podle metody firmy Bruker Daltonik GmbH, Chemického ústavu SAV a kombinací obou těchto metod. Jednotlivé kmeny byly identifikovány na základě analýzy intracelulárních ribozomálních proteinů hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF. V případě nejednoznačnosti výsledků byla u daných kmenů vyizolována DNA a sekvenována doména D1/D2 26S rRNA. Identifikace kmenů byla provedena srovnáním jejich hmotnostních spekter se spektry sekvenovaných kmenů v programu MALDI Biotyper 3.0. Výsledkem byly hodnoty skóre, na jejichž základě byla posouzena vzájemná podobnost kmenů. Z celkového počtu 84 kmenů, jich 18 bylo předem sekvenováno a sloužily tak jako vzorové kmeny pro porovnání s neznámými izoláty. Dohromady 51 kmenů bylo jednoznačně taxonomicky zařazeno do 18 fylogenetických skupin na úrovni druhu. Pro celkem 6 kmenů byla biotypizace hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF opakována z důvodu nejednoznačnosti výsledků. U 15 kmenů nebylo taxonomické zařazení jasně určeno, a proto byly navrženy na sekvenaci domény D1/D2 26S rRNA. Pouze jeden kmen z celkového množství nebylo možné na základě sekvenování identifikovat, a proto byla izolace DNA opakována. V případě 8 kmenů byly výsledky sekvenování shodné s původně navrženým taxonomickým zařazením. Naopak zbylých 6 kmenů bylo identifikováno jako jiný druh. U 20 vybraných kmenů byly stanoveny základní charakteristiky pomocí mikrobiologických metod. Byl pozorován vzhled kolonií na tuhém médiu a také vzhled kultur v tekutém médiu. Dále pak byla stanovena konstanta radiálního růstu a přítomnost ureázy. V neposlední řadě bylo provedeno mikroskopické pozorování buněk a kvasná zkouška na sacharidových médiích.
|
|
|
Yeasts of polyphyletic genus Cryptococcus - characteristics and occurence in the nature
Švecová, Natália ; Stratilová,, Eva (oponent) ; Schusterová,, Hana (vedoucí práce)
Yeasts of genus Cryptococcus belong to the Basidiomycetes, a wide group with different geographical sharing in nature. Many of them rank among human pathogens that endanger immunocompromised patients. Thanks to the big diversity at the level of subspecies, various species of the genus Cryptococcus show different molecular characteristics. Their identification is difficult because of the presence of polysaccharide capsule that surrounds the cell of some species. This work deals with the identification of species occurring in meadows and gardens. The 79 yeasts samples are identified by MALDI-TOF MS. The influence of different culture media on the identification results is monitored simultaneously with the identification. Since a capsule is present in many species, another parameter to be monitored is the influence of the sample preparation method and the matrix on the identification. 51 samples of yeasts of the genus Cryptococcus are identified at the species level in the experimental part. Selected samples are further subjected to the determination of characteristics by conventional microbiological methods. The determined parameters are the presence of urease, radial growth constant, susceptibility to antimycotics, fermentation and assimilation of sugars, growth in the presence of alcohols and growth in the absence of vitamins. The yeast samples are classified into yeast species based on microbiological results. Biotyping resulted in identification of selected samples in the species Filobasidium magnum, Filobasidium oeirense and Filobasidium wieringae. Other samples showed ambiguous identification. As these species have the same properties, they could not be distinguished by the selected microbiological tests.
|
|
|
Bakteriální kontaminace rybích produktů - mikrobiologický a MALDI TOF přístup
GÁPOVÁ, Pavlína
Tato diplomová práce byla zaměřena na mikrobiální kontaminaci rybího masa. Jako vzorová ryba byl vybrán kapr obecný (Cyprinus carpio). Cílem práce bylo optimalizovat podmínky pro růst bakterií za použití čtyř různých růstových médií a tří různých teplot. Inkubace proběhla v čase 0, 72 a 120 hodin od usmrcení ryby a vzorky byly inkubovány v 0, 4 a 8°C. Jako růstová média byly použity agary vyrobené z vývaru z kapra obecného (Cyprinus carpio), amura bílého (Ctenopharyngodon idella), pstruha duhového (Oncorhynchus mykiss) a jako kontrola byl přidám běžně používaný agar na bázi hovězího. Po inkubaci byly získané bakteriální kolonie analyzovány pomocí MALDI-TOF MS. Zároveň byly na dalších vzorcích masa uchovávaných za stejných podmínek provedeny dvě chemické analýzy. Jejich cílem bylozjištění, jak se bude v čase měnit obsah ATP a jeho metabolitů (Hx+R a Hx), a laktátu. Práce byla rozdělena do 4 fází. Nejnáročnější fází celého projektu, a to jak časově, tak manuálně, byla příprava vzorků pro testování na MALDI-TOF MS. Obsah ATP a laktátu v mase byl detekován vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií - ultrafialovým zářením (HPLC-UV). Výsledky práce neprokázali vliv složení růstového média na konečné mikrobiální společenstvo. Jako nejvýraznější faktor ovlivňující růst mikroorganismů se ukázala být teplota. Bakterie prokazatelně více a rychleji rostly při vyšší teplotě. Nejnižší a nejpomalejší růst byl zaznamenán u vzorků rostoucích v nulové teplotě. Druhým významným faktorem, ovlivňujícím především druhové složení bakteriálního společenstva, byl čas od usmrcení ryby do doby testování. Zatímco společenstvo vyrostlé na médiích očkovaných v čase 0 a 72 hodin od zabití bylo relativně pestré, na médiích očkovaných v čase 120 hodin od zabití už se podařilo izolovat téměř výlučně bakterie Pseudomonas spp. Analýzy obsahu ATP a laktátu prokázali, že při nižších teplotách - respektive teplotě 0 °C dochází nejen k významnému zpomalení růstu bakterií, ale i ke zpomalení procesu autolýzy. Rozdíly při skladování ve 4 a 8 °C už nebyly signifikantně rozdílné.
|
|
|
Molekulární identifikace flebotomů
Hlavačková, Kristýna ; Dvořák, Vít (vedoucí práce) ; Straka, Jakub (oponent)
Předložená diplomová práce se věnuje identifikaci zástupců rodů Phlebotomus a Sergentomyia z podčeledi Phlebotominae. Druhy rodu Phlebotomus se podílí na přenosu virových a bakteriálních infekcí, spolu se zástupci novosvětského rodu Lutzomyia jsou také jedinými prokázanými přenašeči parazitických protozoí rodu Leishmania. Druhy rodu Sergentomyia přenáší prvoky sesterského rodu Sauroleishmania, který infikuje plazy, ale již dlouhou dobu se objevují spekulace o jeho možném zapojení do přenosu savčích leishmanií. Tato podezření pramení zejména z opakovaných nálezů savčích leishmanií v jejich trávicím traktu. Přesné druhové určení medicínsky důležitých zástupců hematofágního hmyzu je naprosto zásadní, mimo jiné k efektivnímu nastavení jejich kontroly. Rutinní určování flebotomů je založeno na morfologických znacích umístěných především na hlavě a genitáliích. Tyto znaky však podléhají vnitrodruhové variabilitě, jejich hodnocení vyžaduje určitou míru zkušenosti a u volně chycených jedinců mohou být poničené, což znemožňuje určení do druhu. Tato práce proto přestavuje dvě alternativy identifikace flebotomů na základě molekulárních znaků. První z nich je DNA-barcoding, přístup založený na sekvenační analýze určitého DNA markeru a jeho porovnání s databází, který se dnes již běžně používá k určování řady...
|
|
|
Analýza lipidů novorozeneckého mázku chromatografickými metodami a hmotnostní spektrometrií
Míková, Radka
(CZ) Mázek (vernix caseosa) je bílý sýrovitý krém na povrchu těla novorozence, který je produkován kůží plodu v posledním trimestru těhotenství a chrání jej před vnějšími vlivy v době před porodem a novorozence v prvních sedmi až čtrnácti dnech života. Vernix caseosa má impregnační a termoregulační vlastnosti, poskytuje ochranu proti infekcím a pomáhá dokončit vývoj kůže a gastrointestinálního traktu. Předčasně narození jedinci mají mázku jen velmi málo nebo jim úplně chybí a jsou tak špatně chráněni proti vnějším vlivům. Proto je důležité důkladně poznat složení mázku a nalézt jeho vhodnou náhradu pro předčasně narozené novorozence. Mázek obsahuje lipidy, proteiny a 80 % vody. Tato práce je zaměřena na lipidy, které tvoří přibližně 10 % vernixu. Byly zavedeny metody základního zpracování vernixu. Byla zoptimalizována izolace, separace a transesterifikace lipidů. Pro separaci byla zvolena tenkovrstvá chromatografie. Lipidy byly detekovány pomocí MALDI-TOF MS a výsledky ověřeny pomocí fragmentačních spekter a transesterifikace. Esterifikované lipidy byly měřeny pomocí plynové chromatografie s hmotnostní detekcí. Pro velké množství lipidů byla jako nejvhodnější zvolena extrakce podle Folche. Lipidový extrakt byl separován pomocí kolonové chromatografie. Optimalizované metody byly aplikovány na sérii...
|
|
|
Ionic polyacetylene type polymers and polymer networks by catalyst-free quaternization polymerization
Faukner, Tomáš
(Doctoral Thesis, 2016, Mgr. Tomáš Faukner, Iontové polymery a polymerní sítě polyacetylenického typu připravené metodou kvaternizační polymerizace) Byla provedena detailní studie složení a konfigurační struktury série iontových π-konjugovaných poly(monosubstituovaných acetylenů) připravených kvaternizační polymerizací (QP) 2-ethynylpyridinu (2EP) s equimolárním množstvím alkyl halogenidu (RX = ethyl bromid, ethyl jodid, nonyl bromid, hexadecyl (cetyl) bromid) jako kvaternizačního činidla (QA). Všechny produkty, dobře rozpustné v polárních rozpouštědlech, vykazovaly stupeň kvaternizace cca. 0.5, což naznačuje, že i nekvaternizované monomery byly zapojeny do polymerního řetězce. Na základě výsledků 1 H NMR, IR a Raman (SERS) spektrálních metod byla určena konfigurační struktura polyacetylenických řetězců připravených polymerů: polymery připravené bez přídavku rozpouštědla vykazovaly více očekávanou nepravidelnou cis/trans konfiguraci, kdežto polymery připravené v roztoku acetonitrilu vykazovaly vysoký podíl cis jednotek. Symetrické bi-pyridylacetylenické monomery, které byly v rámci této studie nasyntetizovány, byly polymerizovány metodou QP za vzniku série nových iontový disubstituovaných polyacetylenických materiálů. Mechanismus, který je používán zejména k polymerizaci monosubstituovaných...
|
|
|
Yeasts of polyphyletic genus Cryptococcus - characteristics and occurence in the nature
Švecová, Natália ; Stratilová,, Eva (oponent) ; Schusterová,, Hana (vedoucí práce)
Yeasts of genus Cryptococcus belong to the Basidiomycetes, a wide group with different geographical sharing in nature. Many of them rank among human pathogens that endanger immunocompromised patients. Thanks to the big diversity at the level of subspecies, various species of the genus Cryptococcus show different molecular characteristics. Their identification is difficult because of the presence of polysaccharide capsule that surrounds the cell of some species. This work deals with the identification of species occurring in meadows and gardens. The 79 yeasts samples are identified by MALDI-TOF MS. The influence of different culture media on the identification results is monitored simultaneously with the identification. Since a capsule is present in many species, another parameter to be monitored is the influence of the sample preparation method and the matrix on the identification. 51 samples of yeasts of the genus Cryptococcus are identified at the species level in the experimental part. Selected samples are further subjected to the determination of characteristics by conventional microbiological methods. The determined parameters are the presence of urease, radial growth constant, susceptibility to antimycotics, fermentation and assimilation of sugars, growth in the presence of alcohols and growth in the absence of vitamins. The yeast samples are classified into yeast species based on microbiological results. Biotyping resulted in identification of selected samples in the species Filobasidium magnum, Filobasidium oeirense and Filobasidium wieringae. Other samples showed ambiguous identification. As these species have the same properties, they could not be distinguished by the selected microbiological tests.
|
|
|
Ionic polyacetylene type polymers and polymer networks by catalyst-free quaternization polymerization
Faukner, Tomáš
(Doctoral Thesis, 2016, Mgr. Tomáš Faukner, Iontové polymery a polymerní sítě polyacetylenického typu připravené metodou kvaternizační polymerizace) Byla provedena detailní studie složení a konfigurační struktury série iontových π-konjugovaných poly(monosubstituovaných acetylenů) připravených kvaternizační polymerizací (QP) 2-ethynylpyridinu (2EP) s equimolárním množstvím alkyl halogenidu (RX = ethyl bromid, ethyl jodid, nonyl bromid, hexadecyl (cetyl) bromid) jako kvaternizačního činidla (QA). Všechny produkty, dobře rozpustné v polárních rozpouštědlech, vykazovaly stupeň kvaternizace cca. 0.5, což naznačuje, že i nekvaternizované monomery byly zapojeny do polymerního řetězce. Na základě výsledků 1 H NMR, IR a Raman (SERS) spektrálních metod byla určena konfigurační struktura polyacetylenických řetězců připravených polymerů: polymery připravené bez přídavku rozpouštědla vykazovaly více očekávanou nepravidelnou cis/trans konfiguraci, kdežto polymery připravené v roztoku acetonitrilu vykazovaly vysoký podíl cis jednotek. Symetrické bi-pyridylacetylenické monomery, které byly v rámci této studie nasyntetizovány, byly polymerizovány metodou QP za vzniku série nových iontový disubstituovaných polyacetylenických materiálů. Mechanismus, který je používán zejména k polymerizaci monosubstituovaných...
|
|
|
Ionic polyacetylene type polymers and polymer networks by catalyst-free quaternization polymerization
Faukner, Tomáš ; Zedník, Jiří (vedoucí práce) ; Balcar, Hynek (oponent) ; Sedlařík, Vladimír (oponent)
(Doctoral Thesis, 2016, Mgr. Tomáš Faukner, Iontové polymery a polymerní sítě polyacetylenického typu připravené metodou kvaternizační polymerizace) Byla provedena detailní studie složení a konfigurační struktury série iontových π-konjugovaných poly(monosubstituovaných acetylenů) připravených kvaternizační polymerizací (QP) 2-ethynylpyridinu (2EP) s equimolárním množstvím alkyl halogenidu (RX = ethyl bromid, ethyl jodid, nonyl bromid, hexadecyl (cetyl) bromid) jako kvaternizačního činidla (QA). Všechny produkty, dobře rozpustné v polárních rozpouštědlech, vykazovaly stupeň kvaternizace cca. 0.5, což naznačuje, že i nekvaternizované monomery byly zapojeny do polymerního řetězce. Na základě výsledků 1 H NMR, IR a Raman (SERS) spektrálních metod byla určena konfigurační struktura polyacetylenických řetězců připravených polymerů: polymery připravené bez přídavku rozpouštědla vykazovaly více očekávanou nepravidelnou cis/trans konfiguraci, kdežto polymery připravené v roztoku acetonitrilu vykazovaly vysoký podíl cis jednotek. Symetrické bi-pyridylacetylenické monomery, které byly v rámci této studie nasyntetizovány, byly polymerizovány metodou QP za vzniku série nových iontový disubstituovaných polyacetylenických materiálů. Mechanismus, který je používán zejména k polymerizaci monosubstituovaných...
|
host ::
RSS.