|
|
Effects of detergents on activity, thermostability and aggregation of immobilized lipases
Bančáková, Anna ; Voběrková, Stanislava (oponent) ; Hermanová, Soňa (vedoucí práce)
The diploma thesis deals with the issue of the effect of tweens on enzymatic activity of model hydrolase both free and immobilized on carbon-based carrier. In theoretical part, structural features, mechanism of action, and specialty applications of microbial lipases are reviewed along with detergent chemistry, with emphasize on tween family of detergents belonging into non-ionic surfactant group. In experimental part, effect of tweens on soluble as well as immobilized hydrolase was examined. Immobilization of commercial preparation of lipase was performed by non-covalent adsorption on graphene oxide as a carrier treated with different tweens (tween 20, 60, 80). The activity was determined spectrophotometrically by p-nitrophenyl laurate assay. Enhancement of soluble Rhizopus arrhizus lipase activity (activity coupling of 104 %) was observed at tween 20 concentration of 10 mmol•dm-3, which is highly above critical micelle concentration of this detergent. On the base of screening study, immobilization protocol comprised the incubation of soluble enzyme at concentration of 0.1 mg•ml-1 in phosphate buffer (pH 7.2) with tween 20 (10.8 mmol•dm-3) and the carrier for one hour. Both soluble and immobilized lipase exhibited maximum activity at approx. 35 °C. Optimal pH of immobilized lipase shifted to 8 compared to soluble form for which pH optimum at 9 was determined. Thermal stability profile follows almost same trend for both soluble and immobilized enzyme samples. The interactions between carrier and enzyme are suggested to be mainly non–covalent (adsorption, electrostatic interactions). No protein leaching was observed under studied conditions, and significant improvement of storage stability of immobilized lipase was achieved (activity retention of 41 % after 110 days) in comparison with soluble lipase (activity retention of 16 % after 42 days).
|
|
|
Využití rozptylových technik při studiu denaturace proteinů
Köbölová, Klaudia ; Kalina, Michal (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Táto bakalárska práca je zameraná na overenie využitia rozptylových techník na štúdium denaturácie proteínov. Teoretická časť je venovaná proteínom a ich vlastnostiam, popisu procesu denaturácie a zoznámenie sa s technikami rozptylu svetla. V experimentálnej časti práce boli skúmané denaturačné účinky štyroch vybraných denaturačných činidiel – močoviny, guanidínium hydrochloridu, dodecylsíranu sodného, síranu meďnatého – na dvoch modelových enzýmoch: lipáza a lyzozým. Denaturačné účinky týchto denaturantov boli študované metódou dynamického rozptylu svetla (DLS). Na opis zmeny vo veľkosti častíc počas denaturácie bol používaný Z-priemer, objemový stred a intenzitná distribúcia, ktoré boli stanovené touto metódou. Všetky testované chemické látky vyvolávali zmenu vo veľkosti enzýmoch. Táto zmena je predpokladaná ako známka denaturácie proteínov. So zvyšujúcou koncentráciou denaturantov sa zvýšil aj účinok denaturácie. Čím viac boli rozvinuté polypeptidové reťazce, tým viac rástla ich intenzita rozptylu. DLS je vďaka svojej citlivosti na odlišné veľkosti častíc vhodnou metódou na stanovenie degradačných zmien v proteíne.
|
|
|
Biocatalysts based on lipases, their immobilization and characterization
Bančáková, Anna ; Voběrková, Stanislava (oponent) ; Hermanová, Soňa (vedoucí práce)
The thesis deals with the issue of immobilized enzymes. In the theoretical part, principal and novel methods of immobilization and types of carriers are reviewed together with practical applications of immobilized enzymes. Particularly, recent utilization of immobilized enzymes in a variety of industries such as food industry, medicine, chemical analysis, bioremediation, and biodiesel production is summarized. Different methodologies including adsorption, entrapment, covalent binding and cross-linking are discussed from the viewpoint of their dis/advantages resulting from the extent and the character of binding and the maintenance of enzyme activity. Among new carriers, the research work done on the utilization of graphene as a novel carrier for enzyme immobilization is particularly reported. In the experimental part, immobilization of commercial preparation of lipase (RA) isolated from microscopic fungi Rhizopus arrhizus was performed by adsorption on polyethylene terephthalate as a carrier. The basic parameters as lipolytic activity, temperature optimum, pH optimum and thermal stability of both soluble as well as immobilized enzyme were determined spectrophotometrically using p-nitrophenyl-laurate (pNPL) as a substrate. Both the soluble and immobilized lipase showed maximum activity at pH 7.2 and a decrease in activity was observed above pH 8 or below pH 6.5. The dependence of activity on pH of reaction medium was more pronounced in the case of immobilized form of enzyme. The soluble and immobilized lipases exhibited maximum activity at a temperature of approximately 30 °C. A drop in activity values was observed when the temperature was increased up to 50 °C and above this temperature the stability of the soluble lipase sharply decreased. On the contrary, thermal stability of immobilized RA lipase was significantly improved. Immobilized form of enzyme possesses activity 3.7 % in comparison to the soluble form.
|
|
|
Stanovení aktivity průmyslově významných enzymů produkovaných mikroorganismy izolovanými z potravinového odpadu
Lymarenko, Sofiia
Při zpracování potravinového odpadu hraje důležitou roli mikrobiom a enzymy, které produkuje. Bacillus licheniformis je jedním ze zástupců mikroflóry při kompostování a zdrojem průmyslově významných hydrolytických enzymů: proteas, lipas a celulas. V rámci diplomové práce byla stanovována enzymatická aktivita pomocí spektrofotometrických metod u sedmi kmenů B. licheniformis izolovaných z potravinového odpadu po dobu 96 až 192 hodin. U všech sedmi kmenů byla prokázána celulasová, proteasová a lipasová aktivita, což se shoduje s dosud publikovanou literaturou. Nejvyšší celulasová aktivita stanovena dvěmi metodami byla zaznamenána u kmene 3A-52 (1 U/ml) a 1A-52 (1,5 U/ml) po 24 hodinách kultivace. pH optimum pro celulasovou aktivitu bylo 7, a teplotní optimum 50 °C až 60 °C. Maximální proteasová aktivita byla detekována později až po 120 a 144 hodinách kultivace u dvou kmenů: 3A-52 (1,3 U/ml) a 3D-42 (1,4 U/ml). Při provedení optimalizace se zjistilo, že pH optimum bylo 9 až 11 a teplotní optimum 40 až 45 °C v závislosti na kmenu. Maximální lipasová aktivita byla přibližně 0,7 U/ml a to po 144 hodinách kultivace u 4D-41 a 3D-42. Teplotní optimum bylo zjištěno při 50 až 60 °C a rozmezí pH optima pro tuto aktivitu bylo velice široké v závislosti na studovaném kmenu. U kmenů s nejvyšší enzymatickou aktivitou byla stanovená růstová křivka, kde nejvyšší celulasová aktivita odpovídala době přechodu bakteriální kultury z exponenciální fáze do stacionární, a nejvyšší lipasová a proteasová aktivita byla zjištěna později až při přechodu ze stacionární fáze do fáze odumírání. Kmeny 3A-52 a 3D-42 vykazovaly nejvyšší aktivitu u všech tří sledovaných enzymů. Následně tyto kmeny izolované při kompostování by mohly být použity pro produkci enzymů v průmyslu.
|
|
|
Odvrhování glykokalyxu u cerkárií ptačích schistosom
Chaloupecká, Jana ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Štěrba, Ján (oponent)
Trichobilharzia spp. jsou ptačí schistosomy příbuzné lékařsky významným lidským parazitům rodu Schistosoma. Penetrující cerkárie jsou dobře známy jako kauzativní agens cerkáriové dermatitidy u lidí. Cerkárie aktivně penetrují kůží definitivního hostitele a transformují se na schistosomula. Tomuto procesu předchází odhození ocásku, dochází k vyprázdnění penetračních žláz a rozsáhlým povrchovým změnám. Jednou z těchto změn je ztráta vysoce imunogenního glykokalyxu, který představuje ochrannou vrstvu ve vodním prostředí. Glykokalyx má specifické složení sacharidových molekul, které jsou vázány k lipidům nebo proteinům membrány tegumentu. O mechanismu jeho odvrhování je poměrně málo informací. Hypotézy jsou založeny na nepřímých důkazech, které navrhují účast peptidáz nebo (fosfo)lipáz z penetračních žláz. Tato práce popisuje změny v povrchové glykosylaci během transformace cerkárií na schistosomula pomocí fluorescenčně značených lektinů a monoklonálních protilátek proti Lewis X antigenu. Lektiny UEA-I, LTA a PNA byly zvoleny jako markery transformace u T. regenti. Dále se tato práce zabývá odvrhováním glykokalyxu cerkárií. Při indukci in vitro vyprazdňování penetračních žláz a značení obsahu žláz jsme pozorovali silnou vazbu sekretů z cirkum- a postacetabulárních žláz na povrch cerkárií T. szidati a...
|
|
| |
|
|
Využití rozptylových technik při studiu denaturace proteinů
Köbölová, Klaudia ; Kalina, Michal (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Táto bakalárska práca je zameraná na overenie využitia rozptylových techník na štúdium denaturácie proteínov. Teoretická časť je venovaná proteínom a ich vlastnostiam, popisu procesu denaturácie a zoznámenie sa s technikami rozptylu svetla. V experimentálnej časti práce boli skúmané denaturačné účinky štyroch vybraných denaturačných činidiel – močoviny, guanidínium hydrochloridu, dodecylsíranu sodného, síranu meďnatého – na dvoch modelových enzýmoch: lipáza a lyzozým. Denaturačné účinky týchto denaturantov boli študované metódou dynamického rozptylu svetla (DLS). Na opis zmeny vo veľkosti častíc počas denaturácie bol používaný Z-priemer, objemový stred a intenzitná distribúcia, ktoré boli stanovené touto metódou. Všetky testované chemické látky vyvolávali zmenu vo veľkosti enzýmoch. Táto zmena je predpokladaná ako známka denaturácie proteínov. So zvyšujúcou koncentráciou denaturantov sa zvýšil aj účinok denaturácie. Čím viac boli rozvinuté polypeptidové reťazce, tým viac rástla ich intenzita rozptylu. DLS je vďaka svojej citlivosti na odlišné veľkosti častíc vhodnou metódou na stanovenie degradačných zmien v proteíne.
|
|
|
Enzymatické modifikace GlcNAc-thiazolinových inhibitorů hexosaminidas
Šmeringaiová, Ingrida ; Weignerová, Lenka (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Tato práce se zabývá problematikou hledání účinných inhibitorů enzymů β-N- acetylhexosaminidas, které jsou odvozeny od 1,2-dideoxy-2'-methyl-α-D-glukopyranoso-[2,1- d]-Δ2'-thiazolinu (NGT). Práce je orientována na produkci inhibitorů odvozených od struktury NGT, acetylací jeho molekuly pomocí volných a na nosičích imobilizovaných lipas. Potenciální inhibitory β-N-acetylhexosaminidas mohou být účinnými nástroji pro studium těchto enzymů v buněčných procesech a taktéž otevírají dveře k nalezení možných terapeutik pro léčbu některých neurodegenerativních chorob, jako např. Alzheimerova nemoc. V práci je věnována pozornost stručné charakterizaci β-N-acetylhexosaminidas, a to hlavně glykosidas ze skupin označovaných GH 20 a GH 84. V experimentech byly konkrétně využity β-N-acetylhexosaminidasy člověka1 a z mikroorganismů Bacteroides thetaiotao-micron, Aspergillus oryzae, Streptomyces plicatus, Talaromyces flavus. Enzymy byly produkované, izolované, purifikované a následně byla otestována jejich aktivita. 6-O-Acetyl-1,2-dideoxy- 2'-methyl-β-D-glukopyranoso-[2,1-d]-Δ2'-thiazolin byl testován jako inhibitor zkoumaných enzymů. Výchozí látka NGT byl připraven modifikovaným postupem podle Knappa2 z 2- acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-α-D-glukopyra-nosy reakcí s Lawessonovým činidlem. Předmětem další...
|
|
|
Odvrhování glykokalyxu u cerkárií ptačích schistosom
Chaloupecká, Jana ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Štěrba, Ján (oponent)
Trichobilharzia spp. jsou ptačí schistosomy příbuzné lékařsky významným lidským parazitům rodu Schistosoma. Penetrující cerkárie jsou dobře známy jako kauzativní agens cerkáriové dermatitidy u lidí. Cerkárie aktivně penetrují kůží definitivního hostitele a transformují se na schistosomula. Tomuto procesu předchází odhození ocásku, dochází k vyprázdnění penetračních žláz a rozsáhlým povrchovým změnám. Jednou z těchto změn je ztráta vysoce imunogenního glykokalyxu, který představuje ochrannou vrstvu ve vodním prostředí. Glykokalyx má specifické složení sacharidových molekul, které jsou vázány k lipidům nebo proteinům membrány tegumentu. O mechanismu jeho odvrhování je poměrně málo informací. Hypotézy jsou založeny na nepřímých důkazech, které navrhují účast peptidáz nebo (fosfo)lipáz z penetračních žláz. Tato práce popisuje změny v povrchové glykosylaci během transformace cerkárií na schistosomula pomocí fluorescenčně značených lektinů a monoklonálních protilátek proti Lewis X antigenu. Lektiny UEA-I, LTA a PNA byly zvoleny jako markery transformace u T. regenti. Dále se tato práce zabývá odvrhováním glykokalyxu cerkárií. Při indukci in vitro vyprazdňování penetračních žláz a značení obsahu žláz jsme pozorovali silnou vazbu sekretů z cirkum- a postacetabulárních žláz na povrch cerkárií T. szidati a...
|
|
|
Effects of detergents on activity, thermostability and aggregation of immobilized lipases
Bančáková, Anna ; Voběrková, Stanislava (oponent) ; Hermanová, Soňa (vedoucí práce)
The diploma thesis deals with the issue of the effect of tweens on enzymatic activity of model hydrolase both free and immobilized on carbon-based carrier. In theoretical part, structural features, mechanism of action, and specialty applications of microbial lipases are reviewed along with detergent chemistry, with emphasize on tween family of detergents belonging into non-ionic surfactant group. In experimental part, effect of tweens on soluble as well as immobilized hydrolase was examined. Immobilization of commercial preparation of lipase was performed by non-covalent adsorption on graphene oxide as a carrier treated with different tweens (tween 20, 60, 80). The activity was determined spectrophotometrically by p-nitrophenyl laurate assay. Enhancement of soluble Rhizopus arrhizus lipase activity (activity coupling of 104 %) was observed at tween 20 concentration of 10 mmol•dm-3, which is highly above critical micelle concentration of this detergent. On the base of screening study, immobilization protocol comprised the incubation of soluble enzyme at concentration of 0.1 mg•ml-1 in phosphate buffer (pH 7.2) with tween 20 (10.8 mmol•dm-3) and the carrier for one hour. Both soluble and immobilized lipase exhibited maximum activity at approx. 35 °C. Optimal pH of immobilized lipase shifted to 8 compared to soluble form for which pH optimum at 9 was determined. Thermal stability profile follows almost same trend for both soluble and immobilized enzyme samples. The interactions between carrier and enzyme are suggested to be mainly non–covalent (adsorption, electrostatic interactions). No protein leaching was observed under studied conditions, and significant improvement of storage stability of immobilized lipase was achieved (activity retention of 41 % after 110 days) in comparison with soluble lipase (activity retention of 16 % after 42 days).
|
host ::
RSS.