|
|
LC-MS/MS studie 1. fáze in vitro biotransformace potenciálních léčiv působících v terapii Alzheimerovy nemoci.
Kuřátková, Aneta ; Kučera, Radim (vedoucí práce) ; Váňová, Nela (oponent)
Doposud nebyla nalezena léčba, která by zcela zastavila progresi Alzheimerovy nemoci. Dříve používaný takrin měl v terapii Alzheimerovy choroby dobré výsledky, nicméně dlouhodobé užívání vedlo k chronické hepatotoxicitě způsobené jeho metabolity. Tato diplomová práce se zabývá sloučeninou 7-fenoxytakrin, která je jedním z nadějných substituovaných derivátů takrinu a mohla by být jedním z kandidátů pro potenciální využití v terapii Alzheimerovy choroby. Z důvodu vzniku hepatotoxických metabolitů takrinu po biotransformaci v játrech se jeví jako nezbytné u molekuly 7-fenoxytakrinu identifikovat jeho vznikající metabolity. V rámci diplomové práce byla provedena in vitro biotransformační studie 7-fenoxytakrinu za použití lidských jaterních mikrosomů. Pro stanovení parentní látky a vznikajících sedmnácti metabolitů byla využita technika vysokoúčinné kapalinové chromatografie spojená s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Výsledky ukázaly vznik šesti monohydroxylovaných a jedenácti dihydroxylovaných metabolitů 7-fenoxytakrinu. Hydroxylace je tedy hlavní metabolická reakce po in vitro mikrosomální biotransformaci. Kromě identifikace metabolitů byla v rámci této diplomové práce provedena i kvantifikační a mikrosomálně stabilitní studie zahrnující stanovení úbytku parentní látky v čase. Dále byl stanoven...
|
|
|
Metabolipidomic profiling of white adipose tissue by UPLC-MS/MS
Rombaldová, Martina
V současné době je obezita vážný problém [1,2]. Ačkoliv by se mohlo zdát, že jde pouze o vyšší příjem potravy oproti energetickému výdeji, jde o složitou metabolickou chorobu, která se váže na lipidový metabolismus v tukové tkáni a buněčnou signalizaci s ním spojenou [3]. Je velmi důležité porozumět biologii tukové tkáně, abychom mohli rozpoznat nové a potencionální terapeutické cíle, které by nám pomohly předcházet a léčit choroby spojené s obezitou [4]. V našem výzkumu jsme využili především analytickou techniku kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) ke studiu metabolismu tukové tkáně a rovněž jsme se zaměřili na vliv omega-3 polynenasycených mastných kyselin (PUFA) na tento metabolismus. Prováděli jsme pokusy na hlodavcích a buněčných liniích a analyzovali jsme bílou tukovou tkáň, vzorky séra/plasmy, buněk a mateřského mléka. Nejprve jsme zavedli několik metod ultraúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí (UPLC-MS/MS) k analýze acylkarnitinů (AC), aminokyselin (AmA) a dalších metabolitů. Tyto metody nám umožnily rozdělit isobarické acylkarnitiny, ačkoliv to není obvykle možné. Použití těchto metod také odhalilo několik acylkarnitinů, t.j. AC s dlouhým řetězcem, karnitin, acylkarnitiny C4 a C6, C4DC stejně tak jako aminokyseliny tyrosin, alanin,...
|
|
|
Biochemie a patobiochemie fylochinonu a menachinonů
Dunovská, Kateřina ; Klapková, Eva (vedoucí práce) ; Uřinovská, Romana (oponent) ; Skoumalová, Alice (oponent)
SOUHRN Vitamin K patří mezi poslední z lipofilních vitaminů, který není v klinických laboratořích rutinně stanovován. Vitamin K působí jako důležitý kofaktor posttranslační γ-karboxylace glutamové kyseliny u vitamin K dependentních proteinů (např. osteokalcin, koagulační faktory II, VII, IX, X). Při nedostatku vitaminu K nejsou tyto proteiny dostatečně karboxylovány a nejsou plně funkční. Deficit vitaminu K bývá spojován s rizikem rozvoje osteoporózy a vyskytuje se např. u malabsorpčních syndromů (pacienti s CF, pacienti s celiakií). Cílem práce bylo vyvinout a validovat HPLC metodu a LC-MS/MS metodu pro stanovení tří forem vitaminu K - vitaminu K1, MK-4 a MK-7 v séru. Po úspěšné validaci obou metod bylo provedeno stanovení těchto vitaminů u různých skupin pacientů a u zdravé populace. Metodou HPLC bylo stanoveno 350 pacientských vzorků, které byly rozděleny do dvou skupin. První skupinu tvořily postmenopauzální ženy s diagnostikovanou osteoporózou a druhou skupinu tvořily postmenopauzální ženy bez diagnostikované osteoporózy. Metodou LC-MS/MS bylo celkem stanoveno 946 vzorků, a to u pacientů s osteoporózou, u pacientů bez prokázané osteoporózy, u zdravých dobrovolníků, u pacientů s osteopénií a u pacientů s CF. Bylo stanoveno referenční rozmezí jednotlivých forem vitaminu K u zdravé populace pomocí...
|
|
|
Charakterizace jaderného proteomu rostlin
Svetláková, Anna
Nukleární proteom obsahuje důležité regulační proteiny, které jsou přímo zapojeny do regulačních mechanismů. Odhaduje se, že přibližně 30 % genů kóduje proteiny, které jsou směrovány do jádra. Široká škála koncentrací proteinů však způsobuje, že některé jaderné proteiny jsou přítomny v koncentracích řádově nižších než ostatní proteiny a jsou tak nedostupné v běžné extrakci celkového proteinu. Tato práce Charakterizace jaderného proteomu rostlin stručně shrnuje poznatky dnešní nukleární proteomiky a shrnuje extrakční protokoly. V experimentální části byly zhodnoceny dva různé frakcionační protokoly. Analýzou jaderných proteinových extraktů bylo navýšeno množství identifikovaných proteinů, ale výsledky kvantitativního porovnání s běžnou extrakcí ukazují, že některé proteiny byly ztraceny či došlo k jejich depleci v průběhu frakcionace. Dále byl studován účinek rostlinných hormonů cytokininů na nukleární proteiny ječmene. Celkově bylo nalezeno 65 známých jaderných proteinů (10 % identifikovaných proteinů v jaderné frakci) a 15 z nich bylo rozdílně zastoupeno v odpovědi na ošetření cytokininy, jedná se např. o RNA helikázu SUB2 nebo protein podílející se na odpovědi na solný stres.
|
|
|
Kvantifikácia proteínov pomocou hmotnostnej spektrometrie a jej využitie pri sledovaní degeneračných zmien proteínu
Blaženiaková, Karina
Posttranslační modifikace proteinů můžou mít důležitou roli v regulačních dráhách, některé z nich sú však výsledkem stresového působení a stárnutí proteinů. Táto bakalářská práce,Kvantifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie a její využití při sledování degeneračních změn proteinů, stručně sumarizuje hlavní posttranslační modifikace související s degeneračními procesy. Experimentální část využívá cílenou analýzu metodou SRM hmotnostní spektrometrie na identifikaci potenciálních míst posttranslačných modifikací. S využitím dostupné lokální spektrální knihovny Hordeum vulgare, byl vybrán vysoko abundantní protein endospermu obilky ječmenu (Serpin-Z4) a optimalizovaná metoda pro cílenou analýzu jeho tryptických peptidů. Celkem bylo sledovaných 14 peptidů reprezentujících víc než 50 % sekvence proteinu. Poškození bylo indukováno inkubací homogenizovaných obilek při teplotě 99 °C po dobu 0,5 - 24 h a též inkubací s peroxidem vodíku s koncentrací 0 - 30 %. Teplotní střes významně snížil zastoupení 7 peptidů a oxidační stres významně snížil zastoupení 4. Mapování těchhle peptidů na 3D strukturu proteinu ukázalo, že většina peptidů s pozměněným zastoupením je pravděpodobně lokalizována na povrchu molekuly a tedy představuje očekávaný cíl stresem vyvolaných modifikací. Nakonec byla vytvořená metoda SRM testována i na extraktech z potravin.
|
|
|
Proteom a metabolom parazitů rodu Phytophthora
Zelená, Pavla
Rod Phytophthora představuje celosvětově rozšířeného patogena s více než stovkou uznaných druhů a jeho ničivý účinek na rostliny má vážný ekonomický a ekologický dopad. Tato diplomová práce s názvem "Proteom a metabolom parazitů rodu Phytophthora" stručně shrnuje znalosti o tomto patogenu, včetně jeho životního cyklu a interakcí s jeho hostitelem. Dále podrobně popisuje dvanáct druhů, které reprezentují šest rozdílných klad vybraných pro experimenty v praktické části diplomové práce. Izoláty druhů rodu Phytophthora byly charakterizovány na proteomové a metabolomové úrovni za použití LC-MS necíleného proteomového profilování a GC-MS analýzy volatilních látek. Na základě výsledků měření byly nalezeny kandidátní molekuly pro cílenou identifikaci druhů rodu Phytophthora a tyto výsledky byly validovány v nezávislém experimentu s P. palmivora a ječmenem. Zjistili jsme, že profilování proteomu může být použito jako nástroj pro rozlišení jednotlivých druhů rodu Phytophthora a že specifické peptidy mohou být použity pro cílené sledování přítomnosti druhů rodu Phytophthora v rostlinách.
|
|
|
Metabolipidomic profiling of white adipose tissue by UPLC-MS/MS
Rombaldová, Martina
V současné době je obezita vážný problém [1,2]. Ačkoliv by se mohlo zdát, že jde pouze o vyšší příjem potravy oproti energetickému výdeji, jde o složitou metabolickou chorobu, která se váže na lipidový metabolismus v tukové tkáni a buněčnou signalizaci s ním spojenou [3]. Je velmi důležité porozumět biologii tukové tkáně, abychom mohli rozpoznat nové a potencionální terapeutické cíle, které by nám pomohly předcházet a léčit choroby spojené s obezitou [4]. V našem výzkumu jsme využili především analytickou techniku kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) ke studiu metabolismu tukové tkáně a rovněž jsme se zaměřili na vliv omega-3 polynenasycených mastných kyselin (PUFA) na tento metabolismus. Prováděli jsme pokusy na hlodavcích a buněčných liniích a analyzovali jsme bílou tukovou tkáň, vzorky séra/plasmy, buněk a mateřského mléka. Nejprve jsme zavedli několik metod ultraúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí (UPLC-MS/MS) k analýze acylkarnitinů (AC), aminokyselin (AmA) a dalších metabolitů. Tyto metody nám umožnily rozdělit isobarické acylkarnitiny, ačkoliv to není obvykle možné. Použití těchto metod také odhalilo několik acylkarnitinů, t.j. AC s dlouhým řetězcem, karnitin, acylkarnitiny C4 a C6, C4DC stejně tak jako aminokyseliny tyrosin, alanin,...
|
|
|
Antioxidační a protizánětlivé účinky bilirubinu.
Valášková, Petra ; Muchová, Lucie (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent) ; Dvořák, Karel (oponent)
Bilirubin (BR) byl dlouho považován pouze za odpadní molekulu s potenciálně toxickými účinky zejména na centrální nervový systém. Později bylo zjištěno, že BR působí i cytoprotektivně a mírně zvýšené koncentrace BR vykazují antioxidační, protizánětlivé a imunomodulační účinky, nicméně přesné mechanismy jsou stále předmětem intenzivního výzkumu. Hlavním cílem této práce bylo studium protektivních účinků BR na experimentálních in vivo a in vitro modelech ve vztahu k zánětu a oxidačnímu stresu. Dílčím cílem práce bylo zavedení a validace analytické metody pro stanovení BR a lumirubinu. Potkanům kmene Gunn a příslušným normobilirubinemickým kontrolám byl aplikován lipopolysacharid (LPS, 6 mg/ml, i.p.) nebo fyziologický roztok. Po 12 hodinách byla odebrána krev a vybrané orgány na analýzu markerů zánětu a jaterního poškození. Primární hepatocyty izolované z jater experimentálních potkanů byly ovlivněny BR a TNF-α, buněčné linie HepG2 a SH-SY5Y byly ovlivněny BR a kyselinou chenodeoxycholovou. Hyperbilirubinemičtí potkani měli po aplikaci LPS ve srovnání s normobilirubinemickými potkany signifikantně sníženou zánětlivou odpověď a stupeň jaterního poškození. U potkanů kmene Gunn jsme pozorovali odlišný profil podskupin leukocytů a zároveň snížení exprese mRNA a koncentrace cytokinů IL-6, TNF-α, IL-1β a...
|
|
|
Metabolipidomic profiling of white adipose tissue by UPLC-MS/MS
Rombaldová, Martina ; Kuda, Ondřej (vedoucí práce) ; Šiklová, Michaela (oponent) ; Čajka, Tomáš (oponent)
V současné době je obezita vážný problém [1,2]. Ačkoliv by se mohlo zdát, že jde pouze o vyšší příjem potravy oproti energetickému výdeji, jde o složitou metabolickou chorobu, která se váže na lipidový metabolismus v tukové tkáni a buněčnou signalizaci s ním spojenou [3]. Je velmi důležité porozumět biologii tukové tkáně, abychom mohli rozpoznat nové a potencionální terapeutické cíle, které by nám pomohly předcházet a léčit choroby spojené s obezitou [4]. V našem výzkumu jsme využili především analytickou techniku kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) ke studiu metabolismu tukové tkáně a rovněž jsme se zaměřili na vliv omega-3 polynenasycených mastných kyselin (PUFA) na tento metabolismus. Prováděli jsme pokusy na hlodavcích a buněčných liniích a analyzovali jsme bílou tukovou tkáň, vzorky séra/plasmy, buněk a mateřského mléka. Nejprve jsme zavedli několik metod ultraúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí (UPLC-MS/MS) k analýze acylkarnitinů (AC), aminokyselin (AmA) a dalších metabolitů. Tyto metody nám umožnily rozdělit isobarické acylkarnitiny, ačkoliv to není obvykle možné. Použití těchto metod také odhalilo několik acylkarnitinů, t.j. AC s dlouhým řetězcem, karnitin, acylkarnitiny C4 a C6, C4DC stejně tak jako aminokyseliny tyrosin, alanin,...
|
|
|
Detection of Sap2 in the secretome of Candida albicans cell wall and secretory mutants
Kollárová, Nikola ; Janďourek, Ondřej (vedoucí práce) ; Konečná, Klára (oponent)
Kandidát: Nikola Kollárová Názov diplomovej práce: Detekcia Sap2 proteínu v sekretóme kmeňov Candida albicans mutantných v bunkovej stene a sekrécii Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra biologických a lékařských věd Complutense University of Madrid, Faculty of Pharmacy, Department of Microbiology II Študijný program: Farmácia Cieľ práce: Cieľom tejto diplomovej práce bolo hľadať proteíny C. albicans podieľajúce sa na sekrécii Sap2 enzýmu vyhodnotením schopnosti degradovať BSA ako zdroj dusíka u niektorých kmeňov C. albicans mutantných v bunkovej stene a sekrécii. Práca bola vykonaná na Department of Microbiology II, Faculty of Pharmacy, Complutense University of Madrid. Metódy: Vzorky supernatantov niekoľkých mutantov C. albicans boli testované SDS- PAGE elektroforézou a zafarbené. Na geli boli pozorované prúžky odpovedajúce BSA a porovnané s kontrolami. Druhá metóda bola vyhodnotená s 96-jamkovými doskami. Výsledky: Bola zistená korelácia medzi absorbanciou a degradáciou BSA. V pilotnom skríningu, kde bola testovaná schopnosť degradovať BSA pomocou metódy s 96-jamkovými doskami boli nájdení niektorí mutanti, ktorí nemali schopnosť degradovať BSA. Tento fakt bol potvrdený SDS-PAGE elektroforézou. Mutanti C. albicans s týmto defektom, čo bolo dokázané obomi metódami,...
|
host ::
RSS.