|
|
Vývoj protokolu pro transientní transfekci buněčné linie HEK293 EBNA1
Šmíd, Jiří ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Rekombinantní proteiny patří mezi důležité biofarmaceutické produkty používané v biomedicínském výzkumu a při léčbě lidských nemocí. Rekombinantní proteiny lze produkovat ve velkém množství stabilní transfekcí nebo rychlejší cestou přechodné transfekce s menšímy výtěžky. Pro zajištění správné biologické aktivity musí protein být náležitě poskládán a posttranslačně modifikován. Jelikož může být těchto modifikací dosaženo pouze expresí v savčích buňkách, staly se hlavním hostitelem expresí komplexních rekombinantních proteinů. V této diplomové práci je popsána přechodná transfekce buněk HEK 293 EBNA1 za použití lineárních polyethyleniminů (PEI). Tyto buňky byly předem adaptované na suspenzní kultivaci v médiu bez séra. Buňky byly transfekovány plasmidy pcDNA3.1, pCI, pEBSV1, pCEP4, pEAK8 a pcDNA5/FRT/TO, všechny nesly reporterový gen SEAP. K porovnání účinností jednotlivých transfekcí byly měřeny koncentrace exprimované alkalické fosfatázy (SEAP) v buněčném supernatantu. Dalším faktorem, který byl optimalizován, byl použitý poměr DNA:PEI; rovněž byly vzájemně srovnány účinnosti transfekcí při použití dvou různých polyethyleniminů. Nejvyšší dosažená exprese byla 50 mg/l SEAPu při transfekci ve 24 jamkových deskách za poměru DNA:PEI 1:5. Při porovnání všech šesti plasmidů měl nejvyšší expresi plasmid pCEP4/SEAP a to i při převedení transfekčního systému do většího objemu.
|
|
|
Vývoj protokolu pro transientní transfekci buněčné linie HEK293 EBNA1
Šmíd, Jiří ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Rekombinantní proteiny patří mezi důležité biofarmaceutické produkty používané v biomedicínském výzkumu a při léčbě lidských nemocí. Rekombinantní proteiny lze produkovat ve velkém množství stabilní transfekcí nebo rychlejší cestou přechodné transfekce s menšímy výtěžky. Pro zajištění správné biologické aktivity musí protein být náležitě poskládán a posttranslačně modifikován. Jelikož může být těchto modifikací dosaženo pouze expresí v savčích buňkách, staly se hlavním hostitelem expresí komplexních rekombinantních proteinů. V této diplomové práci je popsána přechodná transfekce buněk HEK 293 EBNA1 za použití lineárních polyethyleniminů (PEI). Tyto buňky byly předem adaptované na suspenzní kultivaci v médiu bez séra. Buňky byly transfekovány plasmidy pcDNA3.1, pCI, pEBSV1, pCEP4, pEAK8 a pcDNA5/FRT/TO, všechny nesly reporterový gen SEAP. K porovnání účinností jednotlivých transfekcí byly měřeny koncentrace exprimované alkalické fosfatázy (SEAP) v buněčném supernatantu. Dalším faktorem, který byl optimalizován, byl použitý poměr DNA:PEI; rovněž byly vzájemně srovnány účinnosti transfekcí při použití dvou různých polyethyleniminů. Nejvyšší dosažená exprese byla 50 mg/l SEAPu při transfekci ve 24 jamkových deskách za poměru DNA:PEI 1:5. Při porovnání všech šesti plasmidů měl nejvyšší expresi plasmid pCEP4/SEAP a to i při převedení transfekčního systému do většího objemu.
|
host ::
RSS.