|
|
Produkce galaktozidázy kvasinkami rodu Cryptococcus rostoucím na laktózovém médiu
Pavlatovská, Barbora ; Molnárová,, Jana (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá studiem indukce - a -galaktosidáz kvasinkami rodu Cryptococcus rostoucím na laktózovém médiu, korelací mezi produkcí těchto enzymů a růstem kvasinek, a jejich následnou biotypizací pomocí hmotnostní spektrometrie. V teoretické části jsou popsány všechny testované a příbuzné kvasinky, hydrolytické enzymy -galaktosidáza a -galaktosidáza, a také použité analytické metody UV-VIS spektrofotometrie a hmotnostní spektrometrie, především MALDI-TOF. Experimentální část obsahuje popis použitého přístrojového vybavení, přípravy potřebných roztoků, kultivace mikroorganismů na laktózovém médiu, měření enzymové aktivity spektrofotometricky a biotypizaci kvasinek hmotnostní spektrofotometrií. Každý z 18 testovaných kmenů kvasinek druhů Cr. carnescens (CCY 17-3-13), Cr. flavescens (CCY 17-3-6, CCY 17-3-15, CCY 17-3-29, CCY 17-3-31, CCY 17-3-33, CCY 17-3-38), Cr. flavus (CCY 17-3-5), Cr. laurentii (CCY 17-3-2, CCY 17-3-9, CCY 17-3-17, CCY 17-3-24), Cr. magnus (CCY 17-4-39, CCY 17-4-40), Cr. saitoi (CCY 17-3-18), Cr. victoriae (CCY 17-3-26) a Bulleromyces albus (CCY17-3-35, CCY 17-3-37) ze Sbírky kultur kvasinek, Chemický ústav SAV (CCY), byl kultivován po dobu 96 hodin v tekutém laktózovém médiu. V průběhu kultivace byl stanovován počet buněk v médiu a enzymová aktivita - a -galaktosidázy v médiu a na povrchu buněk. Laktózové médium nebylo vhodným kultivačním médiem pro všechny kvasinky rodu Cryptococcus, protože některé kmeny na něm rostly pomalu (CCY 17-3-29, CCY 17-3-5, CCY 17-3-26, CCY 17-3-35), nebo vykazovaly dlouhou adaptační fázi (CCY 17-3-2, CCY 17-3-6). Porovnání růstových křivek a grafů produkce aktivit povrchové -galaktosidázy v průběhu kultivace ukázalo, že mezi nimi není žádná blíže specifikovatelná závislost a výsledky tak nepotvrdily očekávaný vliv tohoto enzymu na růst kmene, ani předpokládaný nárůst produkce -galaktosidázy vlivem kultivace na laktóze. Nejrychlejší růst na laktóze vykazoval kmen Cr. carnescens CCY 17-3-13, který produkoval na svém povrchu velmi nízké aktivity tohoto enzymu. Relativně zvýšené množství tohoto enzymu bylo na povrchu kvasinek pozorováno jen v případě typového kmene Cr. laurentii CCY 17-3-2, kmene Cr. flavescens CCY 17-3-31 a Cr. flavus CCY 17-3-5. Stejně tak se značně lišila produkce -galaktosidázy kapsulárními kmeny, což vylučuje předpokládaný vliv tohoto enzymu na přestavbu a degradaci ochranné kryptokokální kapsuly. Výjimku tvořily pouze kmeny Cr. flavescens, které obecně můžeme považovat za producenty povrchové -galaktosidázy indukované laktózovým médiem. V ostatních případech byla produkce tohoto enzymu záležitostí jednotlivého kmene, ne všeobecně druhu, např. v případě typového kmene Cr. laurentii. Obdobná indukce byla ovšem pozorována i u jiných kvasinek a hub, a proto jakákoliv souvislost s kapsulí byla vyloučena. V souvislosti se zvoleným kultivačním médiem bylo druhým cílem práce otestovat vhodnost laktózového média pro biotypizaci kvasinek rodu Cryptococcus hmotnostní spektrometrií. Naměřená čárová hmotnostní spektra vykazují při vzájemném porovnání nízké podobnostní skóre, takže není možné spolehlivě určit, o jaký druh se jedná. Taktéž dělení zástupců rodu Cryptococcus podle fylogenetických linií nebylo programem Biotyper provedeno správně a i blízce si příbuzné kmeny byly zařazeny na odlišné vývojové větve. Výsledky testování tak řadí laktózu k nevhodným médiím pro biotypizaci mikroorganismů hmotnostní spektrometrií.
|
|
|
Vliv kultivačního média na identifikaci kvasinek rodu Cryptococcus hmotnostní spektrometrií
Jurnečková, Alena ; Vadkertiová, Renata (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Rod Cryptococcus je v oblasti klinické mikrobiologie znám pro svoji obtížnou identifikaci a taxonomické zařazení. Pro tuto bakalářskou práci bylo vybráno celkem 22 kmenů kvasinek rodu Cryptococcus. Větší část kmenů byla nejprve sekvenována analýzou D1/D2 domény LSU rRNA genu. Pro kultivaci byly zvoleny tři typy médií – YPD, bramborový a Sabouraudův agar. Vzorky byly upraveny dle normované metody firmy Bruker Daltonik, Chemického ústavu SAV a kombinací těchto dvou metod. Identifikace byla provedena metodou hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF. Získaná spektra byla porovnána příslušným softwarem a vyhodnocena na základě specifického algoritmu. Nejvhodnější médium pro kultivaci a tedy biotypizaci s procentuálně nejvyšším skórem bylo YPD (Yeasts pepton dextrose). Naopak nejméně vhodným kultivačním médiem byl Sabouraudův agar (SA), který dosáhl nejmenší procentuální úspěšnosti dle parametrů daných algoritmem firmy Bruker Daltonik. V případě metod úpravy a aplikace vzorku dosáhla nejvyšší úspěšnosti kombinovaná metoda při použití YPD média. Výsledkem kompletní analýzy jsou dendrogramy pro jednotlivá média zobrazující genetickou podobnost kmenů kvasinek. Dendrogram znázorňuje zařazení jednotlivých kmenů do příslušných skupin. Do fylogenetické skupiny Cr. laurentii I (označení větve v dendrogramu A) byly správně zařazeny kmeny Cr. flavescens (CCY 17-3-28, CCY 17-3-30) a Cr. laurentii (CCY 17-3-2). Přestože kmen Cr. flavus (CCY 17-3-5) vykazuje podobnost s kmenem Cr. flavescens, nepatří do této fylogenetické skupiny. Do fylogenetické skupiny Cr. laurentii II (označení větve B) byly umístěny kmeny Cr. carnescens (CCY 17-3-13) a Cr. victoriae (CCY 17-3-26). Kmeny Cr. magnus (CCY 17-4-39, CCY 17-4-40) se vyznačují podobností s těmito kmeny, ale do fylogenetické skupiny II nepatří. Kmeny Cr. gastricus (CCY 17-5-1) a Cr. diffluens (nezařazený) tvoří větev s označením C. Cr. aerius (CCY 17-4-9), který byl také do této skupiny zařazen, jsme navrhli na sekvenční analýzu, neboť jeho spektrum spíše naznačuje, že se jedná o kmen Cr. diffluens. Větev dendrogramu, nesoucí označení D, obsahuje kmeny Bulleromyces albus (CCY 17-3-35, CCY 17-3-36) a Cr. saitoi (CCY 17-3-18, CCY 17-4-2). Sekvenovaný Cr. albidus (CCY 17-4-1), nesekvenovaný Cr. diffluens (CCY 17-4-13) a Cr. terreus (CCY 17-8-1) se řadí do skupiny označenou písmenem E. Vzhledem k tomu, že sekvenovaný kmen Cr. diffluens se vyskytl už ve skupině C, byl kmen CCY 17-4-13 navržen na sekvenční analýzu. Do této skupiny se řadí také sekvenovaný Cr. aerius (CCY 17-25-1), který však tvoří samostatnou větev v dendrogramu v rámci skupiny. Poslední skupinu, označenou písmenem F, tvoří Cr. macerans (CCY 17-19-3) a také kontrolní kmeny Cr. neoformans var. neoformans (CCY 17-1-4, CCY 17-1-5).
|
|
|
Biotypizace askomycetních kvasinek
Jurnečková, Alena ; Dudášová,, Hana (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Pro biotypizaci MALDI-TOF bylo vybráno celkem 84 izolátů kvasinek například z vody, rostlin, ovocných plodů nebo půdy. Veškeré kmeny byly kultivovány na sladinovém agaru a YPD médiu. Vzorky pro biotypizaci byly upraveny podle metody firmy Bruker Daltonik GmbH, Chemického ústavu SAV a kombinací obou těchto metod. Jednotlivé kmeny byly identifikovány na základě analýzy intracelulárních ribozomálních proteinů hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF. V případě nejednoznačnosti výsledků byla u daných kmenů vyizolována DNA a sekvenována doména D1/D2 26S rRNA. Identifikace kmenů byla provedena srovnáním jejich hmotnostních spekter se spektry sekvenovaných kmenů v programu MALDI Biotyper 3.0. Výsledkem byly hodnoty skóre, na jejichž základě byla posouzena vzájemná podobnost kmenů. Z celkového počtu 84 kmenů, jich 18 bylo předem sekvenováno a sloužily tak jako vzorové kmeny pro porovnání s neznámými izoláty. Dohromady 51 kmenů bylo jednoznačně taxonomicky zařazeno do 18 fylogenetických skupin na úrovni druhu. Pro celkem 6 kmenů byla biotypizace hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF opakována z důvodu nejednoznačnosti výsledků. U 15 kmenů nebylo taxonomické zařazení jasně určeno, a proto byly navrženy na sekvenaci domény D1/D2 26S rRNA. Pouze jeden kmen z celkového množství nebylo možné na základě sekvenování identifikovat, a proto byla izolace DNA opakována. V případě 8 kmenů byly výsledky sekvenování shodné s původně navrženým taxonomickým zařazením. Naopak zbylých 6 kmenů bylo identifikováno jako jiný druh. U 20 vybraných kmenů byly stanoveny základní charakteristiky pomocí mikrobiologických metod. Byl pozorován vzhled kolonií na tuhém médiu a také vzhled kultur v tekutém médiu. Dále pak byla stanovena konstanta radiálního růstu a přítomnost ureázy. V neposlední řadě bylo provedeno mikroskopické pozorování buněk a kvasná zkouška na sacharidových médiích.
|
|
|
Yeasts of polyphyletic genus Cryptococcus - characteristics and occurence in the nature
Švecová, Natália ; Stratilová,, Eva (oponent) ; Schusterová,, Hana (vedoucí práce)
Yeasts of genus Cryptococcus belong to the Basidiomycetes, a wide group with different geographical sharing in nature. Many of them rank among human pathogens that endanger immunocompromised patients. Thanks to the big diversity at the level of subspecies, various species of the genus Cryptococcus show different molecular characteristics. Their identification is difficult because of the presence of polysaccharide capsule that surrounds the cell of some species. This work deals with the identification of species occurring in meadows and gardens. The 79 yeasts samples are identified by MALDI-TOF MS. The influence of different culture media on the identification results is monitored simultaneously with the identification. Since a capsule is present in many species, another parameter to be monitored is the influence of the sample preparation method and the matrix on the identification. 51 samples of yeasts of the genus Cryptococcus are identified at the species level in the experimental part. Selected samples are further subjected to the determination of characteristics by conventional microbiological methods. The determined parameters are the presence of urease, radial growth constant, susceptibility to antimycotics, fermentation and assimilation of sugars, growth in the presence of alcohols and growth in the absence of vitamins. The yeast samples are classified into yeast species based on microbiological results. Biotyping resulted in identification of selected samples in the species Filobasidium magnum, Filobasidium oeirense and Filobasidium wieringae. Other samples showed ambiguous identification. As these species have the same properties, they could not be distinguished by the selected microbiological tests.
|
|
|
Vliv složení kultivačního média na hmotnostní spektra kvasinek druhů Cryptococcus laurentii a Cryptococcus flavescens
Ledvina, Vojtěch ; Breierová, Emília (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Cryptococcus laurentii a Cryptococcus flavescens jsou nefermentující kvasinky tvořící extracelulární polysacharidovou kapsuli. Jedná se o saprofytické druhy, nicméně Cr. laurentii je znám i jako oportunní patogen u imunokomprimovaných jedinců. Dříve byl Cr. flavescens považován za synonymum Cr. laurentii, v současnosti je ale klasifikován jako samostatný druh náležící do fylogenetické skupiny I Cr. laurentii. V experimentální části bylo 28 kmenů druhů Cr. laurentii, Cr. flavescens a Cr. victoriae biotypizováno pomocí MALDI-TOF MS. Buňky byly kultivovány na třech různých médiích (Sabouraudův, YPD a bramborový agar) a proteiny byly extrahovány třemi metodami. Sledován byl vliv složení původního média, ze kterého byly kmeny přeočkovány, na kvalitu spekter, vhodnost jednotlivých metod pro různá média, dále zda složení média ovlivňuje kvalitu spekter a na závěr byly všechny kmeny porovnány s typovým kmenem Cr. laurentii CCY 17-3-2. Bylo zjištěno, že vliv původního substrátu nemá zásadní vliv na kvalitu spekter a stejně tak složení kultivačního média. Rozhodující je metoda přípravy vzorku. Nejkvalitnější spektra byla detekována při kultivaci na YPD agaru a promytí buněk ethanolem. Bramborový agar byl shledán nevhodným pro kultivaci kvasinek rodu Cryptococcus, protože při růstu buněk dochází ke značné produkci extracelulárních polysacharidů znesnadňujících extrakci proteinů. Všechny kmeny byly dále srovnány s typovým kmenem Cr. laurentii CCY 17-3-2 a byly vytvořeny MSP dendrogramy na základě podobnosti spekter. Při vzájemném srovnání všech kmenů byly kmeny úspěšně rozděleny na všech médiích do příslušných druhů. V závěru byly srovnány sekvence D1/D2 domén LSU genu vybraných kmenů a fylogenetický strom byl porovnán s MSP denrogramy.
|
|
|
Biotyping of Cryptococcus laurentii group using mass spectrometry
Jäger, Jakub ; Breierová, Emília (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Cryptococcus laurentii has been classically considered a saprophytic species, although several cases of human and animal infection have been already reported. This species is reported to be heterogenous. The taxonomy of yeast Cryptococcus laurentii was always highly ambiguous. The application of molecular biology and bioinformatic methods led to dividing of searched strains to two distinct phylogenetic groups, some varieties were recognized as species and the locution „Cryptococcus laurentii group“ was introduced. The taxonomy of this group is likely not definitive and with advancing knowledge will change. Our aim was the identification of individual species within this group based on matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight mass spectrometry (MALDI – TOF MS), which has recently been described as a rapid, reliable, cost-effective and powerful tool for analyzing of microorganisms, even on variety level. Generally, the yeasts of genus Cryptococcus form highly resistant polysaccharide capsules and produce large amount of extracellular polysaccharides, therefore belong to so called „difficult“ cases for biotyping. The experimental protocol has been optimized for MS analysis of this genus on the selected strains of Cr. neoformans, Cr. laurentii and Cr. magnus from the Culture Collection of Yeasts (CCY).Thirty-three strains, originally classified as Cryptococcus laurentii has been identified by chosen method. These strains were distributed into six different groups according their spectra similarities. It was selected at least one strain of each group, which was classified based on the sequence analysis of the D1/D2 domains of the LSU rRNA gene. This strain (with known sequence) became representative for its group. Type strain of Cryptococcus laurentii (CCY 17-3-2) belongs to the group I. Its MS spectrum of ribosomal proteins differ from mass spectra of all other biotyped species, even with strains identified as Cryptococcus laurentii was the similarity of the spectra low, which could be caused by identification of two different varieties. The group II is represented by Cryptococcus laurentii CCY 17-3-17. Except this strain, thirteen more strains belong to the group II. The group III represents Cryptococcus flavescens CCY 17-3-29. This group included 12 additional strains with almost identical mass spectra. Group IV included only one strain (CCY 17-3-13), which was identified as Cryptococcus carnescens based on gene sequence analysis. Similarly, one representative (CCY 17-3-5) has the group V. Strain CCY 17-3-5 was identified as Cryptococcus flavus. The last group VI of three members represents strain 17-3-35 identified as Bulleromyces albus. While Cr. laurentii and Cr. flavescens belong to phylogenetic group I and Cr. carnescens to the phylogenetic group II, four strains giving two types of different MS spectra and identified as Cr. flavus (1 strain) and Bulleromyces albus (3 strains) were excluded from „Cr. laurentii group.“
|
|
|
Taxonomic classification of yeasts associated with meadow plants
Čurillová, Natália ; Ing.Hana Dudášová, Ph.D. (oponent) ; Horváthová, Ágnes (vedoucí práce)
In total 60 yeast strains isolated from meadow flowers were selected for identification using MALDI-TOF biotyping. Selected yeast strains were prepared according to standard (Bruker) method and method developed at Institute of Chemistry SAS in Bratislava for MALDI-TOF yeast identification. To acquire valuable data two cultivating media were used. The principle of identification embody in comparing obtained mass spectra according to the score of selected yeast strain isolated from meadow plants, formerly identified by physicobiochemical properties (verification of their taxonomic classification) or the new isolates (their identification) with mass spectra of the reference yeast cultures. Reference yeast cultures were identified by sequencing the D1/D2 of 26S rRNA domain. In total 53 yeast strains were identified by biotyping at species level. The remaining 7 yeast strains were designed to be identified by sequencing the D1/D2 26S rRNA domain as the reference mass spectra were not available. The highest abundance of yeast species was as follows Metschnikowia pulcherrima (12 %), Rhodotorula spp. (12 %), Cystofilobasidium infirmominiatum (10 %), Metschnikowia reukaufii (7 %), Metschnikowia fructicola (7 %), Sporobolomyces metaroseus (7 %), Hanseniospora uvarum (5 %), Rhodotorula mucilaginosa (5 %), Meyerozyma guillermondii (5 %), Cystofilobasidium macerans (3 %) a Rhodotorula dairenensis (3 %), and yeast strains of species Candida bombi, Pichia kudravzievii, Cystofilobasidium capitatum, Cystofilobasidium macerans, Solicoccozyma aeria, Sporidiobolus salmonicolor, Papiliotrema flavescens, Sporidiobolus metaroseus, Sporidiobolus pararoseus and Cryptococcus wieringae were identified as well. In general, the most diverse abundance of yeast species were isolated from meadow plants comparing to the older studies.
|
|
|
Yeasts of polyphyletic genus Cryptococcus - characteristics and occurence in the nature
Švecová, Natália ; Stratilová,, Eva (oponent) ; Schusterová,, Hana (vedoucí práce)
Yeasts of genus Cryptococcus belong to the Basidiomycetes, a wide group with different geographical sharing in nature. Many of them rank among human pathogens that endanger immunocompromised patients. Thanks to the big diversity at the level of subspecies, various species of the genus Cryptococcus show different molecular characteristics. Their identification is difficult because of the presence of polysaccharide capsule that surrounds the cell of some species. This work deals with the identification of species occurring in meadows and gardens. The 79 yeasts samples are identified by MALDI-TOF MS. The influence of different culture media on the identification results is monitored simultaneously with the identification. Since a capsule is present in many species, another parameter to be monitored is the influence of the sample preparation method and the matrix on the identification. 51 samples of yeasts of the genus Cryptococcus are identified at the species level in the experimental part. Selected samples are further subjected to the determination of characteristics by conventional microbiological methods. The determined parameters are the presence of urease, radial growth constant, susceptibility to antimycotics, fermentation and assimilation of sugars, growth in the presence of alcohols and growth in the absence of vitamins. The yeast samples are classified into yeast species based on microbiological results. Biotyping resulted in identification of selected samples in the species Filobasidium magnum, Filobasidium oeirense and Filobasidium wieringae. Other samples showed ambiguous identification. As these species have the same properties, they could not be distinguished by the selected microbiological tests.
|
|
|
Taxonomic classification of yeasts associated with meadow plants
Čurillová, Natália ; Ing.Hana Dudášová, Ph.D. (oponent) ; Horváthová, Ágnes (vedoucí práce)
In total 60 yeast strains isolated from meadow flowers were selected for identification using MALDI-TOF biotyping. Selected yeast strains were prepared according to standard (Bruker) method and method developed at Institute of Chemistry SAS in Bratislava for MALDI-TOF yeast identification. To acquire valuable data two cultivating media were used. The principle of identification embody in comparing obtained mass spectra according to the score of selected yeast strain isolated from meadow plants, formerly identified by physicobiochemical properties (verification of their taxonomic classification) or the new isolates (their identification) with mass spectra of the reference yeast cultures. Reference yeast cultures were identified by sequencing the D1/D2 of 26S rRNA domain. In total 53 yeast strains were identified by biotyping at species level. The remaining 7 yeast strains were designed to be identified by sequencing the D1/D2 26S rRNA domain as the reference mass spectra were not available. The highest abundance of yeast species was as follows Metschnikowia pulcherrima (12 %), Rhodotorula spp. (12 %), Cystofilobasidium infirmominiatum (10 %), Metschnikowia reukaufii (7 %), Metschnikowia fructicola (7 %), Sporobolomyces metaroseus (7 %), Hanseniospora uvarum (5 %), Rhodotorula mucilaginosa (5 %), Meyerozyma guillermondii (5 %), Cystofilobasidium macerans (3 %) a Rhodotorula dairenensis (3 %), and yeast strains of species Candida bombi, Pichia kudravzievii, Cystofilobasidium capitatum, Cystofilobasidium macerans, Solicoccozyma aeria, Sporidiobolus salmonicolor, Papiliotrema flavescens, Sporidiobolus metaroseus, Sporidiobolus pararoseus and Cryptococcus wieringae were identified as well. In general, the most diverse abundance of yeast species were isolated from meadow plants comparing to the older studies.
|
|
|
Biotypizace askomycetních kvasinek
Jurnečková, Alena ; Dudášová,, Hana (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Pro biotypizaci MALDI-TOF bylo vybráno celkem 84 izolátů kvasinek například z vody, rostlin, ovocných plodů nebo půdy. Veškeré kmeny byly kultivovány na sladinovém agaru a YPD médiu. Vzorky pro biotypizaci byly upraveny podle metody firmy Bruker Daltonik GmbH, Chemického ústavu SAV a kombinací obou těchto metod. Jednotlivé kmeny byly identifikovány na základě analýzy intracelulárních ribozomálních proteinů hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF. V případě nejednoznačnosti výsledků byla u daných kmenů vyizolována DNA a sekvenována doména D1/D2 26S rRNA. Identifikace kmenů byla provedena srovnáním jejich hmotnostních spekter se spektry sekvenovaných kmenů v programu MALDI Biotyper 3.0. Výsledkem byly hodnoty skóre, na jejichž základě byla posouzena vzájemná podobnost kmenů. Z celkového počtu 84 kmenů, jich 18 bylo předem sekvenováno a sloužily tak jako vzorové kmeny pro porovnání s neznámými izoláty. Dohromady 51 kmenů bylo jednoznačně taxonomicky zařazeno do 18 fylogenetických skupin na úrovni druhu. Pro celkem 6 kmenů byla biotypizace hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF opakována z důvodu nejednoznačnosti výsledků. U 15 kmenů nebylo taxonomické zařazení jasně určeno, a proto byly navrženy na sekvenaci domény D1/D2 26S rRNA. Pouze jeden kmen z celkového množství nebylo možné na základě sekvenování identifikovat, a proto byla izolace DNA opakována. V případě 8 kmenů byly výsledky sekvenování shodné s původně navrženým taxonomickým zařazením. Naopak zbylých 6 kmenů bylo identifikováno jako jiný druh. U 20 vybraných kmenů byly stanoveny základní charakteristiky pomocí mikrobiologických metod. Byl pozorován vzhled kolonií na tuhém médiu a také vzhled kultur v tekutém médiu. Dále pak byla stanovena konstanta radiálního růstu a přítomnost ureázy. V neposlední řadě bylo provedeno mikroskopické pozorování buněk a kvasná zkouška na sacharidových médiích.
|
host ::
RSS.