|
|
Kultivace klíšťaty přenášených babesií a charakterizace jejich proteasomu jako nového terapeutického cíle
REICHENSDÖRFEROVÁ, Dominika
Klíšťaty přenášená babesie je důležitou hrozbou pro lidi i zvířata. V porovnání s její příbuznou malárií jsou tito parazité infikující Apikomplexa široce rozšíření a v současné době pro léčbu babesiósy neexistuje specifický lék. Proto se v této práci zaměřujeme na optimalizaci kultivace B. divergens v kultuře bovinních erytrocytů (in vitro) a B. microti v BALB/c myších (in vivo). 26S proteasom babesií byl ověřen naší laboratoří jako terapeutický cíl. Pro optimalizaci izolace proteasomu babesií bylo aplikováno několik strategií, použivaných pro izolaci 26S proteasomu P. falciparum, mezi které patří ultrasonikace, mechanická homogenizace a ultracentrifugace. Poté byla pro purifikaci 26S proteasomu z lyzátů B. microti použita metoda ionexové chromatografie. Mezi budoucí cíle patří optimalizace protokolů pro purifikaci proteasomu B. microti ionexovou chromatografií, imunoprecipitací a pomocí afinity k ubiquitinu. Poté bude purifikovaný proteasom analyzován zjištěním substrátové specifity katalytických podjednotek, metodou CryoEM, popřípadě proteinovou krystalografií. Hlavním cílem dlouhodobého projektu laboratoře je navrhnout a ověřit selektivní inhibitor proteasomu, který by mohl být využit pro chybějící specifickou léčbu babesiosy.
|
|
|
Příprava a charakterizace vazebných partnerů fosducinu.
Kylarová, Salome ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
AABBSSTTRRAAKKTT Fosducin (Pdc) je vysoce konzervativní fosfoprotein, který hraje důležitou roli v regulaci G- proteinové signalizace ve fotoreceptorových buňkách sítnice. Jeho funkce spočívá ve vazbě Gtβγ dimeru G-proteinu transducinu, čímž dochází k poklesu množství dostupného transducinu a modulaci signálu. Funkce fosducinu je negativně regulována prostřednictvím fosforylace a následné interakce s proteinem 14-3-3. Přestože je mechanismus této regulace již do jisté míry znám, narůstá zájem o poznání jeho dalších interakčních partnerů, jmenovitě SUG1 a CRX. SUG1 je podjednotka 26S proteasomu, která zajišťuje mnoho biologických funkcí, zejména pak degradaci mnoha transkripčních faktorů. Jeho úloha v regulační dráze fosducinu není stále dostatečně prozkoumána, ale pravděpodobně se podílí na transportu fosducinu do proteasomu k jeho degradaci. Pro bližší studium tohoto proteinu byly připraveny a testovány jeho čtyři různé expresní konstrukty pro nalezení optimálních podmínek pro jeho expresi a purifikaci. Výsledky těchto purifikací naznačily, že SUG1 vytváří stabilní a velmi dobře rozpustné vysokomolekulární oligomery. Tyto domněnky byly následně potvrzeny měřením dynamického rozptylu světla a analytickou ultracentrifugací. Jeho chování je však plně v souladu s jeho dobře prozkoumaným archeálním homologem,...
|
host ::
RSS.