|
|
Imobilizace galaktosidasy a její využití v potravinářské technologii
Dobešová, Natálie
Tato diplomová práce se zabývá problematikou imobilizace galaktosidasy a jejím vyu-žitím v potravinářské technologii. β-galaktosidasa původu Kluyveromyces lactis byla imobilizována za použití dvou metod, konkrétně enkapsulace a sesíťování. Cílem en-kapsulace bylo získat hydrogelové kapsle tvořené biopolymerní matricí na bázi alginá-tu sodného, sesítěného chloridem vápenatým pro opakované katalytické využití. Dru-hou zvolenou metodou bylo sesíťování enzymu na nosiči tvořeném magnetickými čás-ticemi modifikovanými chitosanem. Aktivita enzymu byla stanovena spektrofotometricky za využití substrátu o-nitrofenyl-β-D-galaktopyranosidu a p-nitrofenolu jako standar-du. Aktivita enzymu byla vyhodnocena ve vzorcích mléka a množství vzniklé laktosy bylo stanoveno polarimetricky. Experimentální výsledky ukázaly, že imobilizovaný enzym na chitosanovém magnetickém nosiči vykazoval vyšší aktivitu ve srovnání se systé-mem na bázi alginátových kapslí, což se potvrdilo i při procesu hydrolýzy laktosy. Hydrolýza laktosy byla nejvíce účinná při použití komerčního enzymu a imobilizova-ného enzymu na magnetickém chitosanu. V obsahu laktosy u vzorků mléka bez enzy-mu a za využití alginátových vápenatých kapslí nebyl staticky významný rozdíl.
|
|
|
Production of human milk oligosaccharides in the cell factory of E. coli
Havrdová, Jana ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Smrček, Stanislav (oponent)
Oligosacharidy lidského mléka patří mezi nejhojnější složky mateřského mléka a jsou nezbytné pro zdravý vývoj novorozence. Izolovat tyto oligosacharidy z živočišného mléka, zejména ty méně hojné, je velmi náročné, a proto je třeba hledat nové způsoby získání těchto látek. Chemické a enzymové syntézy těchto sloučenin jsou pracné a nákladné a poskytují nízké výtěžky. Inovativním přístupem k syntéze HMO jsou bakteriální buněčné továrny, v nichž geneticky upravené bakteriální kmeny mohou využívat levné sacharidy jako substráty a přeměňovat je na specifické oligosacharidy. Cílem této práce je prozkoumat možnosti využití vybraných bakteriálních kmenů (E. coli) pro produkci oligosacharidů lidského mléka. U laktosy jako sacharidového substrátu musí být bakteriální hostitel deficientní na β-galaktosidasu, jinak by byl substrát degradován. Pro zýšení příjmu laktózy v buňce lze do hostitelského organ- ismu vnést gen crp, který kóduje pozitivní transkripční regulátor (Catabolite Acti- vator Protein - CAP). Klonovaný plazmid - pRSFDuet-1-crp byl transformován do vybraného bakteriálního kmene. Laktóza z buněk byla purifikována gelovou chro- matografií a vliv zvýšené exprese CAP na příjem laktózy do buněk byl analyzován pomocí různých analytických metod, jako je TLC, HPLC a komerční laktózový test. Klíčová slova:...
|
|
|
Inženýrství mikrobiálních glykosidáz pro změnu syntetického potenciálu
Hovorková, Michaela ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Glykosidázy (EC 3.2.1.) neboli glykosidhydrolázy jsou enzymy katalyzující štěpení glykosidové vazby mezi dvěma sacharidy nebo mezi sacharidem a aglykonem. Za vhodných reakčních podmínek (zvláště snížení aktivity vody v reakční směsi) jsou tyto enzymy schopné glykosidovou vazbu též syntetizovat. Cílenou mutagenezí katalytického centra enzymů je možné potlačit nebo úplně zrušit jejich hydrolytickou aktivitu. Enzymová syntéza pomocí glykosidáz umožňuje připravit bioaktivní galaktosidy, např. ligandy galektinů. Předkládaná práce se zabývá zejména -galaktosidázou z Bacillus circulans, její rekombinantní expresí a mutagenezí. V první části práce byl mnou navržený komerčně připravený plazmid -galaktosidázy z B. circulans izoformy A použit k rekombinantní expresi v E. coli. Bylo nutné optimalizovat podmínky produkce enzymu. Jelikož jde o velký protein (189 kDa) byl použit expresní vektor pCOLD II a chladová kultivace při 15 řC. Enzym je specifický pro tvorbu glykosidové vazby β-1,4 a byl využit na syntézu komplexních tri- a tetrasacharidových ligandů, které nelze připravit s hrubým komerčním preparátem obsahujícím nežádoucí enzymové aktivity. Dále byla pomocí PCR s mutantními primery provedena cílená mutageneze katalytického nukleofilu v aktivním centru tohoto enzymu, čímž byl vytvořen mutant v pozici...
|
|
| |
host ::
RSS.