|
|
Optimalizace metody PCR-RFLP pro taxonomické zařazení kvasinek
Olivová, Radana ; Vadkertiová, Renata (oponent) ; Vránová, Dana (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá optimalizací metody PCR – RFLP pro taxonomické zařazení kvasinek. Konvenční metody pro identifikaci kvasinek jsou časově náročné. Molekulárně biologické metody založené na PCR slouží k rychlé a precizní identifikaci v porovnání s tradičními fenotypovými metodami. V této práci byla použita molekulárně biologická metoda PCR – RFLP, která bere v úvahu , že v ribozomální DNA kvasinek se opakují konzervativní nekódující oblasti(tzv. spacery), jež jsou charakteristické pro každý druh i kmen. Pomocí PCR se amplifikovaly specifické úseky DNA, které byly štěpeny restrikčními endonukleázami a získané fragmenty jsou identifikovány pomocí horizontální elektroforézy. V literární rešerši jsou zpracovány informace o kvasinkách, jejich taxonomii a molekulárně biologických metodách.
|
|
|
Taxonomické zařazení kvasinek rodu Saccharomyces z vybraných matric
Mašitová, Lucie ; Vadkertiová, Renata (oponent) ; Vránová, Dana (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá optimalizací metod kultivace, izolace a identifikace jednotlivých kmenů kvasinek z vybraných matric využitím metod molekulární biologie. Jako matrice byly použity hrozny, listy vinné révy a půda z vinice. Protože kvasinky jsou nedílnou součástí fermentačních procesů, používají se tedy i při výrobě vína, u kterého ovlivňují organoleptické vlastnosti. K identifikaci kvasinkových kmenů byla použita metoda PCR-RFLP. Pro analýzu byly použity úseky kvasinkové DNA, které jsou specifické pro každý druh. Tyto úseky byly pomocí PCR naamplifikovány a následně podrobeny restrikční analýze pomocí specifických restrikčních endonukleas. Získané fragmenty byly detekovány horizontální elektroforesou. V literární rešerši jsou zpracovány základní informace o vinařství, kvasinkách, jejich kultivaci a izolaci, PCR, restrikční analýze a horizontální elektroforese.
|
|
|
Vliv kultivačního média na identifikaci kvasinek rodu Cryptococcus hmotnostní spektrometrií
Jurnečková, Alena ; Vadkertiová, Renata (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Rod Cryptococcus je v oblasti klinické mikrobiologie znám pro svoji obtížnou identifikaci a taxonomické zařazení. Pro tuto bakalářskou práci bylo vybráno celkem 22 kmenů kvasinek rodu Cryptococcus. Větší část kmenů byla nejprve sekvenována analýzou D1/D2 domény LSU rRNA genu. Pro kultivaci byly zvoleny tři typy médií – YPD, bramborový a Sabouraudův agar. Vzorky byly upraveny dle normované metody firmy Bruker Daltonik, Chemického ústavu SAV a kombinací těchto dvou metod. Identifikace byla provedena metodou hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF. Získaná spektra byla porovnána příslušným softwarem a vyhodnocena na základě specifického algoritmu. Nejvhodnější médium pro kultivaci a tedy biotypizaci s procentuálně nejvyšším skórem bylo YPD (Yeasts pepton dextrose). Naopak nejméně vhodným kultivačním médiem byl Sabouraudův agar (SA), který dosáhl nejmenší procentuální úspěšnosti dle parametrů daných algoritmem firmy Bruker Daltonik. V případě metod úpravy a aplikace vzorku dosáhla nejvyšší úspěšnosti kombinovaná metoda při použití YPD média. Výsledkem kompletní analýzy jsou dendrogramy pro jednotlivá média zobrazující genetickou podobnost kmenů kvasinek. Dendrogram znázorňuje zařazení jednotlivých kmenů do příslušných skupin. Do fylogenetické skupiny Cr. laurentii I (označení větve v dendrogramu A) byly správně zařazeny kmeny Cr. flavescens (CCY 17-3-28, CCY 17-3-30) a Cr. laurentii (CCY 17-3-2). Přestože kmen Cr. flavus (CCY 17-3-5) vykazuje podobnost s kmenem Cr. flavescens, nepatří do této fylogenetické skupiny. Do fylogenetické skupiny Cr. laurentii II (označení větve B) byly umístěny kmeny Cr. carnescens (CCY 17-3-13) a Cr. victoriae (CCY 17-3-26). Kmeny Cr. magnus (CCY 17-4-39, CCY 17-4-40) se vyznačují podobností s těmito kmeny, ale do fylogenetické skupiny II nepatří. Kmeny Cr. gastricus (CCY 17-5-1) a Cr. diffluens (nezařazený) tvoří větev s označením C. Cr. aerius (CCY 17-4-9), který byl také do této skupiny zařazen, jsme navrhli na sekvenční analýzu, neboť jeho spektrum spíše naznačuje, že se jedná o kmen Cr. diffluens. Větev dendrogramu, nesoucí označení D, obsahuje kmeny Bulleromyces albus (CCY 17-3-35, CCY 17-3-36) a Cr. saitoi (CCY 17-3-18, CCY 17-4-2). Sekvenovaný Cr. albidus (CCY 17-4-1), nesekvenovaný Cr. diffluens (CCY 17-4-13) a Cr. terreus (CCY 17-8-1) se řadí do skupiny označenou písmenem E. Vzhledem k tomu, že sekvenovaný kmen Cr. diffluens se vyskytl už ve skupině C, byl kmen CCY 17-4-13 navržen na sekvenční analýzu. Do této skupiny se řadí také sekvenovaný Cr. aerius (CCY 17-25-1), který však tvoří samostatnou větev v dendrogramu v rámci skupiny. Poslední skupinu, označenou písmenem F, tvoří Cr. macerans (CCY 17-19-3) a také kontrolní kmeny Cr. neoformans var. neoformans (CCY 17-1-4, CCY 17-1-5).
|
host ::
RSS.