|
|
Role proteinu Prp45 v expresi a zrání mRNA
Abrhámová, Kateřina ; Půta, František (vedoucí práce) ; Pichová, Alena (oponent) ; Janderová, Blanka (oponent)
Souhrn Prp45p ze Saccharomyces cerevisiae a Snw1p ze Schizosaccharomyces pombe jsou pro eukaryotní buňku nepostradatelné proteiny, které vykazují vysoký stupeň homologie se savčím transkripčním regulátorem a nestřihovým faktorem SNW/SKIP. Analyzovali jsme esenciální funkci těchto proteinů v obou kvasinkách a nalezli mutaci (prp45(1-169)), která u mutantního kmen s odpovídající chromozomální delecí způsobuje citlivost vůči vyšší kultivační teplotě a hypersenzitivitu vůči cykloheximidu, hydroxymočovině, látce calcofluor white a inhibitorům polymerizace mikrotubulů. Při kultivaci ve 30řC jsou tyto kvasinky často prodloužené, deformované a větší než wt. Po synchronizaci ve 37řC zastavují kvasinky prp45(1-169) svůj růst s dvojnásobným obsahem DNA. Zjistili jsme, že teplotní senzitivita kmene prp45(1-169) není překonána a hypersenzitivita vůči mitotickým jedům je jen částečně potlačena odstraněním intronu z genu TUB1. To odlišuje prp45(1-169) od těch mutant v sestřihových faktorech, jež vykazují na tubulinu závislý blok v G2/M fázi, který může být překonán pomocí verze tub1 bez intronu . Pomocí analýzysestřihu in vitro jsme zjistili, že sestřih optimálních substrátů není narušen. Porovnávali jsme stabilitu a obsah RNA mezi prp45(1-169) a wt kvasinkami při různých teplotách pomocí microarray analýzy. Expresi a...
|
|
| |
|
|
Homeostáze kationtů alkalických kovů patogenních kvasinek rodu Candida
Elicharová, Hana ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent) ; Půta, František (oponent)
Kvasinky rodu Candida jsou oportunní patogeny schopné vyvolat závažné systémové infekce u imunokompromitovaných pacientů. Virulence jednotlivých druhů kan- did závisí mimo jiné na jejich odolnosti vůči proměnlivosti vnějšího prostředí. Udržování homeostáze kationtů alkalických kovů, čili na jedné straně schopnost akumulovat dostatečné množství draselných iontů a na straně druhé úspěšně čelit jejich vysoké extracelulární koncentraci, je nezbytné pro růst a virulenci kandid. V rámci této práce jsme popsali souvislost mezi tolerancí k solím a rezistencí k flukonazolu u šesti druhů kandid a možný mechanismus této interakce. Flu- konazol hyperpolarizuje plasmatickou membránu buněk kandid a zvyšuje tak nespecifický vstup kationtů alkalických kovů do buňky, čímž výrazně narůstá citli- vost kandid k solím těchto kationtů. Popsaný mechanismus má obecnou platnost, nebot' flukonazol zvyšuje senzitivitu kandid i k dalším kladně nabitým látkám, které vstupují do buňky v závislosti na velikosti membránového potenciálu. Účinek flukonazolu na membránový potenciál a tedy i na vstup kationtů alkalických kovů do buňky obrátil naši pozornost k homeostázi draselných kationtů, jejichž relativně vysoká...
|
|
| |
|
|
CUG kodon u patogenních kvasinek rodu Candida
Marečková, Lucie ; Půta, František (oponent) ; Heidingsfeld, Olga (vedoucí práce)
1. Abstrakt Mnoho druhů kvasinek rodu Candida překládá standardní leucinový kodon CUG jako serin, ovšem ne v 100% případů. Ukázalo se, že dvojí specifita CUG kodonu se vyvíjela pomocí mechanismu zahrnujícího dvojznačné kódování zprostředkované unikátní tRNACAG, která je in vitro častěji aminoacylována serinem než leucinem. Tato dvojznačnost byla tolerována některými kandidami více jak 170 miliónů let. Prozatím nejlepším možným vysvětlením této tolerance je, že nestandardní překlad CUG způsobil vznik genové diverzity a umožnil produkci nového fenotypu odolnějšího vůči stresovým podmínkám. Důležitým krokem byla zároveň redukce negativního vlivu dvojznačné translace pomocí klíčových mutací ve struktuře ser-tRNACAG. Kandidy se staly cenným experimentálním modelem pro objasnění změn v genetickém kódu. Zatímco byly důsledky dvojího překladu CUG kodonu studovány hlavně u druhu Candida albicans, ve spojitosti s kvasinkou Candida parapsilosis nebylo toto téma prozatím diskutováno. Vyřešení struktury sekretované aspartátové proteázy Sapp1p z C. parapsilosis nám poskytlo nástroj ke studiu případů možného vlivu dvojznačného překladu CUG kodonu. Gen SAPP1 obsahuje jeden CUG kodon a na jeho místo dosazovaný serin se ve struktuře proteinu nachází ve smyčce v těsné blízkosti aktivního místa.
|
|
|
Rekombinantní příprava receptorů potkaních NK buněk v expresním systému HEK293T.
Celadová, Petra ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent)
NK buňky hrají důležitou roli v imunitní odpovědi proti nádorovým a virově infikovaným buňkám. Exprimují široké spektrum různých povrchových receptorů, mezi které patří také NKRP1. Jedná se o rodinu C-lektinových receptorů, která zahrnuje receptory jak s inhibiční, tak s aktivační funkcí. Poměrně nedávno byly pro některé molekuly z této rodiny nalezeny ligandy, které patří taktéž do nadrodiny C-lektinových receptorů . Jedná se mj. o potkaní Clr-b, fyziologický ligand pro NKRP1B. Bylo zjištěno, že inhibiční funkce receptorového komplexu NKRP1B-Clr-b může být nabourána proteinem potkaního cytomegaloviru RCTL, virové verze Clr-b, která slouží jako falešný ligand pro NK buňky. Cílem mé diplomové práce bylo klonování a příprava zmíněných C-lektinových receptorů v transientně transfekované HEK293T buněčné linii v suspenzní kultuře. Tento expresní systém umožňuje získat proteiny s uspokojivým výsledkem, a to v jejich nativní konformaci, čímž je odstraněna potřeba časově náročných a často bezvýsledných pokusů o renaturaci proteinů připravených pomocí bakteriálního expresního systému v E. coli. Úspěchu bylo dosaženo v případě Clr-b a NKRP1B receptorů potkaních kmenů WAG i SD. Proteiny byly purifikovány za pomoci chelatační chromatografie následované gelovou filtrací, identifikovány hmotnostní spektrometrií a...
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
host ::
RSS.