|
|
Mechanismus regulace funkce fosducinu
Kacířová, Miroslava ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Předkládaná disertační práce volně navazuje na mou práci diplomovou. Zabývá se studiem 30kDa proteinu fosducinu (Pdc) a mechanismem regulace jeho funkce prostřednictvím vazby s 28kDa adaptorovým proteinem 14-3-3. Oba tyto proteiny se účastní signální dráhy spojené s G-proteiny, především v procesu vidění. Pdc váže komplex βγ podjednotek heterotrimerního G-proteinu transducinu (Gtβγ) a tím brání zpětné reasociaci Gtβγ s podjednotkou Gtα, čímž blokuje přenos světelného signálu. Tento proces se pravděpodobně uplatňuje při dlouhodobé adaptaci na změnu intenzity světla. Regulační funkce Pdc je dále regulována jeho fosforylací a následnou vazbou na protein 14-3-3. Na základě dostupných dat bylo spekulováno, že vazba 14-3-3 je klíčová pro inhibici interakce mezi fosforylovaným Pdc (Pdc-PP) a Gtβγ. Vznik komplexu 14-3-3/Pdc-PP pak vede k reasociaci trimerního transducinu a zesílení přenosu světelného signálu. Mechanismus, jakým protein 14-3-3 inhibuje interakci Pdc s Gtβγ, je však stále neznámý. Cílem této disertační práce bylo objasnit strukturu volného Pdc a jeho komplexu s proteinem 14-3-3 a s pomocí získaných dat navrhnout mechanismus regulace funkce Pdc. Struktura Pdc a komplexu 14-3-3/Pdc-PP byla studována celou řadou biofyzikálních metod včetně maloúhlového rozptylu rentgenového záření (SAXS), NMR,...
|
|
|
Studium interakce forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a s proteinem 14-3-3
Vácha, Petr ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra fyzikální a makromolekulární chemie Autoreferát doktorské práce Studium interakce forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a s proteinem 14-3-3 RNDr. Petr Vácha Školitel: Prof. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. Praha 2015 Abstrakt Tato doktorská práce se zabývá studiem interakcí lidského forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a s regulačním proteinem 14-3-3. Hlavním cílem této práce byla detailní charakterizace interakce DNA-vazebné domény proteinu FOXO4 se dvěmi kanonickými sekvencemi DNA a dále objasnění úlohy proteinu 14-3-3 v procesu regulace funkce FOXO4. Transkripční faktory FOXO jsou účinnými aktivátory transkripce genů, čímž ovlivňují celou řadu buněčných procesů. Protein FOXO4 patří do rodiny forkhead transkripčních faktorů, což je skupina několika desítek proteinů, jejichž společným znakem je velmi konzervovaná DNA-vazebná doména. Podstata DNA-vazebné specifity těchto proteinů, tedy co přesně determinuje drobné odlišnosti ve vazebných vlastnostech jednotlivých forkhead proteinů, je i přes množství dostupných strukturních dat stále nejasné. Proto byla provedena detailní charakterizace interakcí mezi DNA-vazebnou doménou proteinu FOXO4 a DNA pomocí rezonance povrchového plazmonu (SPR) a časově- rozlišené fluorescenční spektroskopie. Výsledky...
|
|
|
Mechanismy aktivace muskarinového M1 receptoru atypickými agonisty
Randáková, Alena ; Doležal, Vladimír (vedoucí práce) ; Mysliveček, Jaromír (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Atypičtí agonisté muskarinových receptorů jsou látky, které se vážou se srovnatelnou afinitou k jednotlivým podtypům receptoru, ale jsou schopny je do určité míry selektivně aktivovat. Molekulární mechanismus této funkční selektivity atypických agonistů není dosud znám a jeho objasnění by mohlo přispět k cílenému vývoji nových funkčně selektivních agonistů vhodných pro léčebné využití. Funkční selektivita atypických agonistů muskarinových receptorů by mohla souviset se způsobem, jakým tyto látky aktivují receptor. Specifická konformační změna receptoru vyvolaná po navázání těchto strukturně složitých agonistů by mohla vést k využití aktivačních mechanismů, které jsou paralelní s aktivačním mechanismem klasických ortosterických agonistů a vést k selektivní aktivaci receptoru. Zjišťovali jsme, zda atypičtí muskarinoví M1 selektivní agonisté xanomelin a N-desmetylklozapin využívají při aktivaci M1 receptoru stejnou kaskádu tzv. aktivačních přepínačů jako klasičtí ortosteričtí neselektivní agonisté karbachol a oxotremorin. Za tímto účelem jsme provedli bodové mutace M1 receptoru v oblasti odpovědné za vazbu ortosterického ligandu (D1053.32 , D993.26 ), v oblasti aktivačního přepínače odpovědného za přenos konformační změny z ortosterického místa do intracelulární části receptoru D712.50 a v oblasti...
|
|
|
Pórotvorné vlastnosti toxinu CyaA bakterie Bordetella pertussis a složení membránové dvojvrstvy.
Rädisch, Robert ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Bordetella pertussis produkuje mnoho virulenčních faktorů mezi které patří adenylát- cyklázový toxin (ACT, CyaA). Tento toxin preferenčně napadá buňky imunitního systému, které mají integrinový receptor CD11b/CD18, a způsobuje tak oslabení imunitního systému hostitele. Na napadené buňky působí CyaA dvěma způsoby: 1) CyaA vytváří v membráně napadené buňky kationt-selektivní póry a způsobuje tak koloidně osmotickou lýzi napadené buňky, 2) CyaA způsobuje konverzi cytosolického ATP na signální molekulu cAMP, což způsobuje ztrátu fyziologických funkcí napadené buňky a taktéž vede k buněčné smrti. Cílem mé práce bylo otestovat vhodnost nového modelového systému ze syntetických lipidů - difytanoylů, pro charakterizaci pórotvorných vlastností adenylát-cyklázového toxinu. V minulosti se k charakterizaci využíval modelový systém z azolektinu, který je složen z mnoha různých lipidů a je tak příliš komplexní pro zjišťování úlohy jednotlivých lipidů. Dále byl zjišťován vliv cholesterolu na aktivitu adenylát-cyklázového toxinu v tomto systému, protože bylo zjištěno, že k translokaci adenylát-cyklázové domény dochází v lipidových raftech, které jsou bohaté na cholesterol. Posledním cílem mé diplomové práce bylo charakterizovat mnou nově objevený typ kanálu s dvěma vodivostními stavy. Klíčová slova: Bordetella...
|
|
|
Vliv zinečnatých kationtů na ionotropní glutamátové receptory
Fraňková, Denisa ; Krůšek, Jan (vedoucí práce) ; Adámek, Pavel (oponent)
Zinek je jedním z hojnějších divalentních kovových iontů v centrální nervové soustavě, kde funguje jako regulátor mnoha proteinů (kanály, receptory, pumpy...), neurosekreční produkt či kofaktor. Zde se zinek nejvíce koncentruje v synaptických váčcích specifických neuronů, které se nazývají zinek-obsahující neurony a jsou podmnožinou glutamátergních neuronů. Kumulace zinku v synaptických váčcích je zajišťována zejména transporterem ZnT3. Odhaduje se, že zinek v synaptických váčcích dosahuje koncentrace až 1 mmol/l a možná i vyšší. Zinek-obsahující neurony se nacházejí především v předním mozku, kde u savců tvoří komplex a neuronální síť, která propojuje většinu mozkové kůry a limbický systém (Frederickson et al. 2000). Jakmile dojde ke stimulaci, zinek je ze synapsí uvolňován (Vogt et al. 2000) a následně ovlivňuje mnoho receptorů, mezi které patří i postsynaptické NMDA receptory (Koh & Choi 1994) a Ca2+ propustné AMPA i kainátové receptory (Hong Z. Yin 1995), napěťově závislé Ca2+ kanály (Atar et al. 1995) a GABAA receptory (Ruiz et al. 2004). Tato bakalářské práce shrnuje efekt zinečnatých kationtů na ionotropní glutamátové receptory. Je zaměřena především na NMDA receptory, které jsou Zn2+ ovlivněny nejvíce. První kapitola je věnována struktuře ionotropních glutamátových receptorů, na kterou pak navazují...
|
|
|
Inhibice nikotinového acetylcholinového receptoru takrinem a jeho deriváty
Skřenková, Kristýna ; Krůšek, Jan (vedoucí práce) ; Doležal, Vladimír (oponent)
Nikotinové acetylcholinové receptory patří mezi ligandem aktivované kanály, které se nacházejí na nervosvalové synapsi a v centrálním a periferním nervovém systému. Aktivita nikotinového receptoru může být ovlivněna řadou farmakologických látek. V této práci jsme se zaměřili na studium inhibičního účinku takrinu a jeho derivátů na nikotinové acetylcholinové receptory svalového a neuronálního typu. Tyto deriváty působí jako inhibitory acetylcholinesterázy a interagují přímo také s nikotinovými acetylcholinovými receptory. Na inhibitorech cholinesteráz je založena převážná část dnešní terapie Alzheimerovy choroby. Mechanismus účinku takrinu a jeho derivátů jsme studovali pomocí metody terčíkové zámku (patch clamp) v konfiguraci měření proudů z celé buňky. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Úloha TRPV1 receptorů v chemokinem CCL2 indukované modulaci nociceptivního synaptického přenosu na míšní úrovni
Adámek, Pavel ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Modulace nociceptivního synaptického přenosu v zadním rohu míšním je velmi důležitá pro vznik a rozvoj řady bolestivých stavů. Hromadící se poznatky naznačují, že TRPV1 (transient receptor potential vanilloid 1) receptor a chemokin CCL2 (C-C motif ligand 2) hrají kritickou roli v modulaci nociceptivního synaptického přenosu na míšní úrovni, obzvláště pak za patologických stavů. Tato diplomová práce se zabývala studiem CCL2 indukované modulace synaptického přenosu v zadním rohu míšním, přičemž cílem práce bylo zejména objasnit roli TRPV1 receptorů v tomto procesu. K objasnění této otázky byla používána elektrofyziologická metoda terčíkového zámku (patch-clamp) a snímání spontánních a miniaturních excitačních postsynaptických proudů (sEPSC a mEPSC) ze superficiálních neuronů zadního rohu míšního, na řezech lumbální míchy potkana. Po akutní aplikaci CCL2 byl u kontrolních jedinců zjištěn nárůst frekvence sEPSC i mEPSC. Tento CCL2 indukovaný nárůst frekvence sEPSC a mEPSC bylo možné zablokovat podáním antagonisty TRPV1 receptoru SB366791. Velikosti amplitud sEPSC i mEPSC nebyly aplikací CCL2, SB366791 či koaplikací CCL2 a SB366791 ovlivněny, což naznačuje, že pozorované změny jsou zprostředkovány převážně presynaptickými mechanismy. Předběžné výsledky ukazují, že CCL2 moduluje synaptický přenos v zadním rohu...
|
|
|
Změny vnitrobuněčného pH kvasinek za stresových podmínek
Divín, Radek ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Název práce: Změny vnitrobuněčného pH kvasinek za stresových podmínek Autor: Radek Divín Katedra / Ústav: Fyzikální ústav Univerzity Karlovy Vedoucí diplomové práce: prof. RNDr. Jaromír Plášek, CSc. Abstrakt: Specifické hodnoty intracelulárního pH (pHi) mohou ovlivnit veškeré biochemické procesy v buňce, což je důvodem důležitosti studia změn intracelulárního pH za stresových podmínek. V práci bylo využito kvasinek Saccharomyces cerevisiae jakožto modelového organismu eukaryotních buněk. Monitorování intracelulárního pH buněk bylo prováděno metodou sychronního skenování fluorescence geneticky kódované fluorescenční sondy pHluorin, lokallizované v cytosolu buněk. Buňky byly vystaveny stresovým podmínkam vlivem chemických změn prostředí. Studovala se schopnost buněk udržet si stálou hodnotu intracelulárního pH v různě kyselých prostředích. Pozornost se věnovala také vlivu glukózy na optimalizování cytosolického pH. Práce se zabývá i změnami intracelulárního pH pod vlivem přítomnosti KCl v suspenzi. Dále se monitoroval pokles cytosolického pH buněk působením protonoforu CCCP. Vliv stresového prostředí na intracelulární pH byl studován z pohledu variací chemických látek a jejich množství v buněčné suspenzi a dále i z pohledu růstové fáze zkomaných buněk. Klíčová slova: Saccharomyces cerevisce, vnitrobuněčné pH,...
|
|
|
Srovnání vybraných karbocyaninových fluorescenčních sond z hlediska jejich použitelnosti při měření změn membránového potenciálu kvasinek.
Mudroňová, Kateřina ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Membránový potenciál je jednou z nejdůležitějších charakteristik živé buňky. Jednou z možností monitorování jeho změn je použití karbocyaninových fluorescenčních sond. V rámci této práce byly metodou synchronně skenované fluorescence prozkoumány vlastnosti několika sond. Z nich byly vybrány tři vhodné látky pro další experimenty jako doplněk k sondám diSC3(3) a diSC3(5), které představují standardní sondy používané v oddělení biofyziky FÚUK. Konkrétně se jedná o sondy diOC3(3), diIC1(3) a diIC2(5). Byla porovnána rychlost jejich akumulace v buňkách S. cerevisiae, na základě které jsme zjišťovali, zda jsou substráty MDR pump. Dále se tato práce zabývá otázkou ekvivalence výsledků obdržených pomocí různých fluoroforů a jejich vzájemného ovlivňování. Pro tyto účely byla zvolena dvojice sond diSC3(3) a diSC3(5), pomocí nichž byl zkoumán vliv acidifikace na membránový potenciál kvasinek S. cerevisiae. Bylo zjištěno, že informace o depolarizaci získané pomocí odlišných sond, se dobře shodují.
|
|
|
Měření vnitrobuněčné koncentrace iontů v mikroorganismech
Vodáková, Adéla ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Diplomová práce se zabývá měřením vnitrobuněčné koncentrace iontů v bakteriích Escherichia coli a kvasinkách Saccharomyces cerevisiae pomocí geneticky kódovaných fluorescenčních sond obsahujících zelený fluorescenční protein (GFP). V úvodu práce shrnuji známé poznatky o tomto proteinu a jeho spektrálních charakteristikách. Pro experimentální část práce byl vybrán senzor reagující na změny pH ve svém okolí změnou poměru intenzity fluorescence dvou pásů v excitačním spektru - poměrový pHluorin. Tato sonda byla otestována jak v bakteriálních, tak v kvasinkových buňkách. Byla sledována schopnost mikrobiálních buněk udržovat si stálou hodnotu cytosolického pH při odlišných vnějších podmínkách, jako je různé pH suspenze, přidání glukózy či KCl do suspenze. V práci je dále řešen problém odstranění příspěvku autofluorescence buněk ze signálu GFP při kalibraci a následném měření vnitrobuněčného pH. Úspěšně byla použita metoda synchronně skenované fluorescence pro potlačení nechtěných příspěvků. Při použití této metody navíc dochází k vylepšení poměru signálu k šumu a tím k zpřesnění odečítaných hodnot cytosolického pH.
|
host ::
RSS.