|
| |
|
|
Calcium homeostasis and modulation of nociceptive synaptic transmission
Sojka, David ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Žurmanová, Jitka (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
3 transient induced by control dorsal root stimulation. Using this model together with transgenic labeling of specific neuronal populations could be useful in the future, especially for pharmacological testing of new analgesic drugs. SOUHRN PRÁCE Předkládaná disertační práce má za cíl přispět k objasnění míšních mechanismů nocicepce. Jedním z důležitých mechanismů podílejících se na vzniku a průběhu řady chronických bolestivých stavů je tzv. centrální sensitizace. Jedná se o formu dlouhodobé modulace synaptického přenosu na míšní úrovni, neboli synaptické plasticity. Tato studie se ve své hlavní části zabývá vývojem metody, která by s využitím techniky Ca imagingu umožnila studovat mechanismy centrální sensitizace in vitro na populaci neuronů zadního míšního rohu. V pokusech provedených na akutních míšních řezech jsme snímali změny fluorescence u Ca-senzitivní sondy FLUO-4 v neuronech zadního míšního rohu. Analýza změn intracelulární koncentrace Ca, ke kterým docházelo během synaptického přenosu vyvolaného stimulací zadního kořene míšního, odhalila dva odlišné typy Ca odpovědí. První typ odpovědi byl synchronizovaný s elektrickou stimulací, zatímco druhý typ, odpovídající uvolnění Ca z vnitřních Ca zdrojů, následoval po určité časové prodlevě po stimulaci. Tyto pozdní Ca odpovědi, nezávislé na aktivaci...
|
|
|
Study of factors influencing the function of MntH, membrane transport protein of E. coli
Jurková, Ingrid ; Urbánková, Eva (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Protein MntH patřící do rodiny transportérů Nramp hraje důležitou roli nejen v homeostáze železa a manganu, ale i při obraně bakteriálních buněk před imunitní reakcí napadeného hostitele. Tento protein transportuje do buňky dvojmocné kovové ionty v symportu s protony, přičemž stechiometrie tohoto transportu se mění v závislosti na membránovém potenciálu a na extracelulárním pH. V první části této práce byl pomocí redistribuční potenciálové sondy diS-C3(3) zkoumán vliv exprese MNTH a transportu dvojmocných iontů přenašečem MntH na membránový potenciál buněk E. coli. Zjistili jsme, že buňky exprimující MNTH jsou hyperpolarizovány a jejich membránový potenciál se depolarizuje po přidání některých dvojmocných kovů. Ve druhé části práce jsme se věnovali teoretickému studiu kinetiky membránových přenašečů popsaných čtyř-, šesti- nebo osmistavovým transportním modelem, do něhož byla zavedena závislost všech rychlostních konstant na membránovém potenciálu. Pomocí matematického modelování byla zkoumána závislost toku přenašečem na různých parametrech transportního modelu, jako jsou například membránový potenciál, koncentrace substrátu nebo náboj substrátu či přenašeče. Byly pozorovány některé jevy, popisované i u proteinu MntH (proměnná stechiometrie transportu a její závislost na potenciálu a pH). Pro detailnější...
|
|
| |
|
|
Analýza uspořádaní vazebné kapsy MDR pumpy Cdr1p patogenní kvasinky Candida albicans - hlavního přispěvatele ke klinické lékové rezistenci
Bartl, Tomáš ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Název práce: Analýza uspořádaní vazebné kapsy MDR pumpy Cdr1p patogenní kvasinky Candida albicans - hlavního přispěvatele ke klinické lékové rezistenci Autor: Tomáš Bartl Katedra / Ústav: Fyzikální ústav UK Vedoucí diplomové práce: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc., Fyzikální ústav UK Abstrakt: Kandidózové infekce jsou častou příčinou úmrtí hospitalizovaných pacientů. U nejvýznamnějšího kvasinkového patogenu, Candida albicans, je za jeho klinicky významnou rezistenci vůči používaným lékům (azolům) zodpovědná nadprodukce proteinů transportních pump, které léčivé látky odstraňují z buněk, a vzniká tak fenomén mnohačetné lékové rezistence - MDR. Cílem této práce bylo ověřit vhodnost použití kmenů kvasinky Saccharomyces cerevisiae využívajících heterologní expresi MDR pump z patogenní kvasinky Candida albicans, a na tomto systému potvrdit výsledky získané přímo na C. albicans s homologní expresí. Skutečnost, že azolová léčiva mikonazol, bifonazol a ketokonazol, a potenciometrická fluorescenční sonda diS-C3(3), jsou substráty pump CaCdr1p a CaCdr2p, ale nikoliv, nebo minimálně, pumpy CaMdr1p, tedy odpovídají dříve publikovaným výsledkům. Za pomoci jednak zónových testů, jednak diS-C3(3) fluorescenční metody, byla studována vazebná kapsa CaCdr1p s využitím strukturně podobných látek vorikonazolu, flukonazolu,...
|
|
|
Functional characterization of MDR pump Pdr5p responsible for multiple drug resistance in yeast Saccharomyces cerevisiae
Sayedová, Shirin ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Jedním z hlavních důvodů selhávání léčby infekcí způsobených patogenními mikroor- ganismy je nadměrná exprese membránových proteinů, které aktivně odstraňují léky z buněk, což vede k fenoménu zvanému mnohočetná léková rezistence MDR. V této práci jsme se zaměřili na funkční charakterizaci MDR pumpy Pdr5p u kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Ověřili jsme, že je možné použít dis-C3(3) fluorescenční metodu pro stanovení vazebných míst, do kterých se substráty vážou ve vazebné kapse pumpy ScPdr5p. Zaměřili jsme se na studium vazebné kapsy ScPdr5p pomocí triazolových derivátů: ravukonazolu, vorikonazolu a flukonazolu. Pomocí zónového testu jsme ukázali, že všechny tři studo- vané triazoly jsou substráty pumpy ScPdr5p. Zjistili jsme, že tyto strukturní analogy mají výrazně odlišný vliv na inhibici transportu potenciometrické fluorescenční sondy dis-C3(3) pumpou ScPdr5p, a také, že ravukonazol s vorikonazolem vzájemně kompetují o transport pumpou ScPdr5p. Využili jsme fluorescenční přístup ke studiu vazby azolů do vazebné kapsy pumpy ScPdr5p pomocí benchmark substrátů, které se vážou selek- tivně pouze do jednoho vazebného místa ve vazebné kapse pumpy ScPdr5p, a podpořili jsme tak hypotézu, že ravukonazol a vorikonazol se vážou do více než jednoho vazebného místa. 1
|
|
|
Studies on molecular interactions of the mu-opioid and TRPV1 receptors
Melkes, Barbora ; Novotný, Jiří (vedoucí práce) ; Blahoš, Jaroslav (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
V této práci jsme zkoumali chování -opioidního receptoru (MOR) a iontového kanálu TRPV1 (transient receptor potential vanilloid 1) v plazmatické membráně buněk a jejich vzájemnou komunikaci. Oba tyto receptory se podílejí na vnímání bolesti a analgezii. Zjistili jsme, že laterální pohyblivost MOR byla silně ovlivněna různými usměrňujícími opioidními agonisty. DAMGO a endomorfin-2 vykazují opačný usměrňovací agonismus vůči MOR. Podle našich výsledků mají také opačné účinky na mobilitu MOR. Morfin vyvolal pouze malé změny v mobilitě MOR. Kromě toho, deplece cholesterolu a blokování G proteinové signalizace za pomoci pertusového toxinu (PTX) ovlivňovaly schopnost agonistů MOR měnit jeho mobilitu. Účinky DAMGO a endomorfinu-2 byly za těchto podmínek sníženy. Na druhé straně jsme pozorovali morfinem zvýšený pohyb MOR po depleci cholesterolu. Samotný PTX neovlivnil pohyb receptoru, ale zcela narušil účinek deplece cholesterolu na morfinem vyvolanou změnu mobility MOR. Dále jsme se zabývali mobilitou TRPV1. Agonista TRPV1 kapsaicin změnil laterální mobilitu TRPV1. Překvapivě, po přidání MOR antagonisty naloxonu se také zvýšil difúzní koeficient TRPV1, ale v menší míře než po kapsaicinu. Agonista MOR DAMGO a antagonista levallorfan neovlivnily mobilitu TRPV1. Zjistili jsme, že kapsaicin i naloxon byly...
|
|
|
Neuroinflammation and mechanisms of neuropathic pain development
Kalynovska, Nataliia ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Hejnová, Lucie (oponent)
Neuropatická bolest se nejčastěji objevuje po poškození nervové tkáně a také jako doprovodný příznak u řady onemocnění nebo jako nežádoucí vedlejší účinek některých cytostatických léčiv. V současné době neuropatická bolest představuje významný klinický problém, jelikož aktuálně dostupná analgestická léčba je stále neuspokojivá. Pro rozvoj nových účinných léčebných postupů neuropatické bolesti je důležité odhalit mechanizmy jejího vzniku. Stále však chybí přesné informace o procesech, které se podílejí na vývoji a udržování neuropatické bolesti. Cílem této dizertacní práce bylo prozkoumat mechanizmy zapojené do vzniku neuropatických bolestivých stavů u několika modelů. Hlavní část práce je zaměřená na studium protizánětlivého účinku blokátoru angiotenzinových receptorů typu 1 (AT1R), losartanu, u dvou již etablovaných modelů periferní neuropatie a to navozené podáním cytostatika paclitaxelu (PIPN) nebo podvázáním míšního nervu (SNL). Další část této práce je věnována zkoumání úlohy vaniloidních receptorů typu 1 (TRPV1) u procesů aktivace míšních neuronů pod vlivem aplikace chemoterapeutika paclitaxelu nebo chemokinu CCL2. Pro dosažení postavených cílů byly použity jak behaviorální, tak i molekulárně biologické metody. U každého modelu byly měřeny odpovědi potkanů na tepelné/mechanické podněty, které...
|
|
|
Study of the differences in the architecture of the binding pockets of two major MDR pumps of yeast Saccharomyces cerevisiae, Pdr5p and Snq2p, using their common substrates
Backová, Lenka ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Mnohonásobná lieková rezistencia (multidrug resistance, MDR) je zodpovedná za po- kles účinnosti liekov na patogénnych mikroorganizmoch alebo nádorových ochoreniach. Jeden z mechanizmov mnohonásobnej liekovej rezistencie je export liekov z bunky pomo- cou membránových transportérov - púmp. Hlavné MDR pumpy kvasinky Saccharomyces cerevisiae sú Pdr5p a Snq2p, ktoré majú vysokú aminokyselinovú sekvenčnú podobnosť. Táto práca sa sústredí na rozdiely týchto púmp, ich väzobné kapsy a ich usporiadanie. Väzobná kapsa pumpy Pdr5p je lepšie preskúmaná, porovnanie výsledkov z merania me- dzi pumpou Pdr5p a Snq2p vedie k rozšíreniu znalosti o väzobnej kapse Snq2p. Pomocou zónového testu určíme spoločné substráty púmp, ketokonazol a bifonazol. Tieto substráty použijeme v meraní pomocou metódy potenciometrickej fluorescenčnej sondy diS-C3(3). Z výsledkov sme zistili, že väzobná kapsa Snq2p má viac väzobných miest. Väzobné kapsy Pdr5p a Snq2p sa navzájom líšia vo väzobných miestach a ich konformá- cii. Avšak konformácia oboch púmp je dynamická, k čomu sme dospeli z výsledkov po pridaní glukózy k bunkám na dodanie energie. 1
|
|
|
Vliv strukturních a farmakologických determinant na proces otevírání kanálu NMDA receptoru
Ladislav, Marek ; Krůšek, Jan (vedoucí práce) ; Bendová, Zdeňka (oponent) ; Zemková, Hana (oponent)
N-metyl-D-aspartátové (NMDA) receptory jsou heterotetramery, složené ze dvou obligatorních glycin-vázajících GluN1 podjednotek a dvou glutamát/glycin vázajících GluN2/3 podjednotek. Tyto receptory zprostředkovávají rychlý synaptický přenos v centrální nervové soustavě, přičemž hrají výraznou roli při vývoji mozku a synaptické plasticitě, která je základním mechanismem procesu učení a paměti. Bylo prokázáno, že dysfunkce NMDA receptorů je spjata s několika neurologickými a psychiatrickými poruchami. NMDA receptory mají specifickou doménovou organizaci. Extracelulárně nejvzdáleněji od membrány se nachází amino-terminální doména, na kterou směrem k membráně navazuje ligand vázající doména (LBD), kde se vážou agonisté. LBD je propojena třemi krátkými polypeptidovými řetězci - linkery s transmembránovou doménou (TMD), kde se nachází vlastní iontový kanál. Receptor je na intracelulární straně zakončen karboxy-terminální doménou. Proces otevírání iontového kanálu NMDA receptoru zahrnuje několik kroků a je založen na funkčním propojení mezi LBD-linkery-TMD, kdy navázáním agonistů do LBD dochází ke konformační změně, jejíž energie je přenášena linkery na TMD, čímž dochází k otevření iontového kanálu. Detaily tohoto přenosu nejsou stále zcela charakterizovány, i když přesná znalost mechanismu otevírání...
|
host ::
RSS.