|
|
Příprava a charakterizace proteinu LmbX zúčastněného v biosyntéze antibiotika linkomycinu
Jiráčková, Petra ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent)
Linkomycin je antibiotikum využívané v klinické praxi. Jeho producentem je Streptomyces lincolnensis. Linkomycin se skládá z aminocukerné a aminokyselinové složky, které jsou spojeny amidovou vazbou. Aminokyselinovým prekurzorem je propylprolin (PPL), jehož biosyntéza probíhá dráhou vycházející z tyrosinu. Modifikovaná PPL dráha byla také objevena u pyrrolobenzodiazepinů (PBD) a hormaomycinu. V biosyntéze PBD je PPL prekuzor dále modifikován reakcemi katalyzovanými specifickými enzymy nepřítomnými v biosyntéze linkomycinu. Geny kódující tyto enzymy by mohly být přeneseny do genového shluku pro biosyntézu linkomycinu. Tímto způsobem bychom mohli získat producenty hybridních antibiotik s lepšími vlastnostmi, a dokonce antimalarickými účinky. PPL dráhy se účastní šest enzymů, které jsou kódovány v genovém shluku pro biosyntézu linkomycinu. První dvě reakce biosyntézy PPL byly již prokázány, proto se tato práce zaměřuje na reakci třetí, kterou by měl podle literatury katalyzovat protein LmbX. Jeho předpokládaná funkce v biosyntéze PPL je hydrolýza C-C vazby. Podle sekvenční homologie však protein LmbX patří do rodiny isomeras. V této práci byl nadprodukován protein LmbX a byla testována jeho aktivita v přítomnosti předpokládaného substrátu. Produkty byly měřeny na kapalinovém chromatografu (UHPLC)....
|
|
|
Charakterizace glycinové smyčky alfa podjednotky mitochondriální procesující peptidasy Saccharomyces cerevisiae
Chytrá, Dana ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Zikánová, Blanka (oponent)
Mitochondriální procesující peptidasa (MPP) je heterodimerní enzym patřící do M16B skupiny metaloendopeptidas. Univerzální funkce tohoto enzymu je v rozeznání a odštěpení velké škály sekvenčně i délkou odlišných presekvencí prekurzorů proteinů určených do mitochondrie. MPP se skládá z katalytické β-MPP a pravděpodobně rozpoznávací α-MPP. Nejkonzervovanější oblastí v α-MPP je tzv. glycinová smyčka (GRL - glycine-rich loop), jejíž předpokládaná funkce je v primární interakci s presekvencí prekurzoru proteinu. Fluorescenčními experimenty je možné sledovat změnu konformace GRL po navázání substrátu. V rámci této diplomové práce byly pomocí metody cílené mutageneze vytvořeny konstrukty kódující α-MPP s jediným reportérovým tryptofanovým zbytkem v pozici 289 nebo 299. Tyto formy α-MPP byly nadprodukovány v buňkách E. coli BL21(DE3)+pGroESL. Aktivity dimeru MPP obsahujícího α-MPP s jediným tryptofanovým zbytkem v reportérové pozici byly porovnány s MPP z divokého kmene S. cerevisiae. Použitým substrátem byl prekurzor kvasinkové malátdehydrogenasy s fúzovanou presekvencí (pMDH) ze tří organismů (kvasinky, myši, a melounu) lišící se svou délkou. Aktivity dimeru obsahujícího α-MPP s reportérovým tryptofanovým zbytkem v pozici 289 se pohybovaly okolo 70 %, zatímco aktivity dimeru obsahujícího α-MPP s...
|
|
|
Komparativní analýza shluků genů pro biosyntézu linkomycinu a celesticetinu.
Koběrská, Markéta ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Kormanec, Ján (oponent)
ZÁVĚRY 1. Byla určena sekvence shluku genů pro biosyntézu linkomycinu z typového kmene S. lincolnensis ATCC 25466. Jeho heterologní exprese ukázala, že shluk je kompletní a dostačuje pro produkci celé molekuly linkomycinu. Porovnání linkomycinových shluků typového kmene S. lincolnensis ATCC 25466 a nadprodukčního kmene S. lincolnensis 78-11 ukázalo řadu odlišností. 2. Identifikace a izolace genového shluku celesticetinu ze S. caelestis ATCC 15084 umožnila určení celé sekvence nesoucí genetickou informaci pro jeho biosyntézu. 3. Pro predikci funkcí jednotlivých genů linkomycinového shluku byly zvoleny dva hlavní přístupy: jednak komparativní analýza s nově charakterizovaným celesticetinovým shlukem i PBD shluky, dalším nástrojem byla inaktivace vybraných genů linkomycinového shluku a analýza jimi produkovaných látek. 3a. Komparativní analýza umožnila přiřadit funkce většině genů linkomycinového i celesticetinového shluku. Nejdůležitějším výstupem je predikce podjednotek NDLS, klíčového enzymu biosyntetické dráhy linkosamidů. Analýza v obecné rovině demonstrovala modulární uspořádání genových shluků na několika úrovních a ozřejmila pravděpodobné procesy molekulární evoluce biosyntézy linkosamidů i PBD sloučenin. 3b. Tři pravděpodobně regulační geny lmbIH, lmbQ a lmbU byly nahrazeny inaktivačními kazetami....
|
|
|
Genetická charakterizace tetracyklinové resistence u vybraných půdních isolátů bakterií.
Hucková, Tereza ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Janata, Jiří (oponent)
GENETICKÁ CHARAKTERIZACE TETRACYKLINOVÉ REZISTENCE U VYBRANÝCH PŮDNÍCH IZOLÁTŮ BAKTERIÍ Abstrakt Rezistence k antibiotikům se stále více rozšiřuje mezi bakteriálními mikroorganizmy. Abychom byli schopní na tuto situaci reagovat, je nutné podrobně porozumět všem mechanizmům rezistence a možnosti rozšiřování genů rezistence v prostředí. V této práci jsme se pokusili identifikovat determinantu rezistence k tetracyklinu u vybraných půdních izolátů grampozitivních i gramnegativních bakterií. Tyto izoláty pocházejí z půdy nehnojené a půdy, která byla hnojena mrvou kontaminovanou tetracyklinem. U izolátů jsme testovali přítomnost dvaceti třech vybraných determinant rezistence k tetracyklinu a přítomnost determinant rezistence k tetracyklinu v knihovně DNA. U izolátů rodu Staphylococcus jsme identifikovali determinantu rezistence tet(K). U izolátu rodu Arthrobacter byl amplifikován fragment DNA primery pro tet(M) determinantu, její přítomnost však nebyla potvrzena sekvenačně. U izolátů rodů Chryseobacterium a Stenotrophomonas nebyla přítomna žádná z testovaných determinant rezistence k tetracyklinu. Podařilo se však prokázat probíhající horizontální přenos genů mezi rody Stenotrophomonas a Chryseobacterium a u rodu Chryseobacterium byly identifikovány geny kódující hybridní protein a efluxní pumpu SmeW, oba...
|
|
| |
|
| |
|
|
Sdílené kroky biosyntetických drah linkomycinu a pyrrolo-benzodiazepinů
Jiráčková, Petra ; Fišer, Radovan (oponent) ; Janata, Jiří (vedoucí práce)
Linkomycin a jeho polosyntetický derivát klindamycin jsou terapeuticky využívaná antibiotika inhibující proteosyntézu v citlivých bakteriích. Jejich struktura se skládá z aminocukerné a aminokyselinové části, které jsou spojeny amidovou vazbou. Před časem byla zjištěna sekvence genového shluku pro biosyntézu linkomycinu a navrženy funkce pro většinu proteinů kódovaných geny shluku na základě porovnání se známými proteiny a inaktivací genů. Již dlouho bylo jasné, že aminokyselinové části linkomycinu (propylprolinu) je příbuzná dihydropyrrolová část pyrrolo[1,4]benzodiazepinů (PBD). Obě tyto části jsou odvozené od L-tyrosinu a prochází z počátku stejnou biosyntetickou dráhou. Další biosyntetické kroky se však rozcházejí. Věří se, že přenos genů z genového shluku pro produkci PBD do biosyntetického genového shluku pro linkomycin by mohl modifikovat strukturu propylprolinu a vylepšit tak vlastnosti linkomycinu, např. zvýšit antimalarické účinky. Nejúčinnějšími antibiotiky jsou alkylované deriváty, jejichž chemická syntéza je velmi složitá, ale mohly by být připraveny pomocí genového inženýrství jako tzv. hybridní antibiotika.
|
|
| |
|
| |
|
| |
host ::
RSS.