|
|
Umlčování exprese transgenů v rostlinách bramboru a v buněčné linii tabáku BY-2
Tyč, Dimitrij ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Honys, David (oponent)
Náhodný objev RNA interference před pár desítkami let u rostlin a její následné popsání Firem et al. v roce 1998 znamenal doslova revoluci v molekulární biologii a řadě dalších oborů. Výzkumníci odkryli rozsáhlý a nečekaný mechanizmus regulace genové exprese na mnoha úrovních u téměř všech studovaných eukaryot. Prvotní studie u rostlin odhalily umlčování exprese z vnějšku dodaných genů i příslušných endogenů. Brzy bylo tedy jasné, že tento proces neslouží organizmům pouze v obraně před viry, ale i před mobilními genetickými elementy a k regulaci vlastních genů. Společným jmenovatelem všech mechanizmů RNAi je dvouvláknová RNA, která je štěpena na malé RNA. Ty pak řídí v součinnosti s řadou dalších proteinů buď štěpení částečně či plně komplementární mRNA či blokují její translaci v procesu posttranskripčního umlčování (PTGS), nebo se v procesu RNA řízené metylace DNA (RdDM) podílejí na umlčování genů na transkripční úrovni doprovázené remodelací chromatinu. Mechanizmy RNAi se uplatňují i při transformaci rostlin, kdy způsobují v odvozených liniích značnou variabilitu a nestabilitu v expresi vnesených genů. Řada biotechnologických postupů ovšem vyžaduje dlouhodobou definovanou a stabilní expresi transgenu, kterou právě RNAi znesnadňuje. Hlavním cílem diplomové práce bylo posoudit vliv vybraných...
|
|
|
Proteomická a funkční charakterizace izoforem PsbO
Duchoslav, Miloš ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Hála, Michal (oponent)
PsbO (mangan-stabilizující protein) je jedním z vnějších proteinů fotosystému II vázaných z luminální strany. Nachází se ve všech oxyfototrofních organismech a zajišťuje správnou funkci Mn4CaO5 klastru, kde probíhá fotosyntetický rozklad vody. Tato práce je zaměřena především na PsbO vyšších rostlin a jeho izoformy - jejich evoluci a funkce. Bioinformatickými analýzami jsme zjistili, že většina vyšších rostlin exprimuje právě dvě izoformy psbO. Fylogenetický strom vytvořený ze sekvencí PsbO má neobvyklou topologii. Na jednotlivé vzájemně paralogní izoformy se neštěpí u báze, jak by se dalo očekávat, ale spíše až na koncích jednotlivých větví, na úrovni čeledí či ještě nižších taxonomických jednotek. V práci jsme navrhli a diskutovali několik hypotéz evoluce izoforem PsbO. Součástí práce byla detailní identifikace spotů na gelech z 2D IEF-SDS PAGE tylakoidů bramboru, ve kterých se vyskytuje PsbO. Ve většině spotů jsme identifikovali konkrétní variantu izoformy. Nepodařilo se nám nalézt žádné posttranslační modifikace PsbO. Optimalizovali jsme metodu exprese psbO špenátu v E. coli a následné purifikace, která umožňuje získat velké množství správně sbaleného rekombinantního proteinu. Pomocí CD spektrometrie jsme zjistili, že při změnách pH typických pro lumen tylakoidů při změně osvětlení se mírně mění...
|
|
|
Studium mechanismu posttranskripčního a transkripčního umlčování transgenů v buněčné linii tabáku BY-2
Čermák, Vojtěch ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
RNA interference je jedním z mechanismů, který umožňuje buňkám regulovat aktivitu genů, ovlivňovat tvorbu a udržování heterochromatinu a chránit je před invazivními nukleovými kyselinami. U rostlin je RNA interference spouštěna přítomností dvoušroubovicové RNA, která je štěpena proteinem Dicer na malé RNA o délce převážně 20-24nt. Tyto malé RNA mohou v komplexu s proteinem Argonaut na základě sekvenční komplementarity řídit štěpení mRNA, blokování translace, či modifikace chromatinu. V důsledku tak může být genová exprese umlčována buď posttranskripčně (tím že je bráněno vzniku proteinu z již vytvořené mRNA, PTGS) a nebo transkripčně (tím že je bráněno vzniku transkriptu, TGS). Záměrem této práce bylo připravení různých způsobů spouštění posttranskripčního umlčování a porovnání jejich funkčnosti a účinnosti. Dalším krokem pak byla příprava systému, který by měl umožnit sledování jednotlivých kroků přechodu posttranskripčního umlčování na umlčování transkripční. Tyto tzv. indikátorové linie by měly dovolit sledovat časování a dynamiku tohoto procesu s využitím fluorescenčních proteinů. Připravovaný systém umožní také vyhodnocení různých faktorů na průběh tohoto procesu - jedním z nich je RNA-dependentní RNA polymeráza 6, která hraje hlavní roli v samovolném spouštění PTGS. V práci je použita jako modelový...
|
|
|
Revealing phosphoproteins playing role in tobacco pollen activated in vitro
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
6 Abstract in Czech Po dopadu na bliznu se zralý pyl tabáku rehydratuje, aktivuje a klíčí z něj pylová láčka. Rehydratace je doprovázena de-represí skladovaných mRNA, z nichž se syntetizují nové proteiny. Při vývoji zralého pylu v rychle rostoucí pylovou láčku se velmi pravděpodobně uplatňují také posttranslační modifikace proteinů, konkrétně fosforylace, jež se podílí na regulaci celé řady buněčných procesů. Vzhledem k tomu, že pouze malý podíl proteinů je v daném okamžiku v buňce fosforylován, bývá nevyhnutelné využít nejrůznější obohacovací techniky. Pro obohacení fosfoproteinů z celkového proteinového extraktu zralého pylu a pylu aktivovaného in vitro 30 minut byla v této diplomové práci aplikována afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu (MOAC), kde byl matricí hydroxid hlinitý. Získaná obohacená frakce byla rozdělena nezávisle dvěma metodami; klasickou dvojrozměrnou elektroforézou (2D-GE) a kapalinovou chromatografií (LC). Hmotnostní spektrometrií (MS) byly analyzovány vzorky získané oběma způsoby dělení, a celkem tak bylo identifikováno 139 fosfoproteinových kandidátů. Fosfopeptidové obohacení využívající oxid titaničitý vedlo k lokalizaci 51 fosforylačních míst, a tak rozšířilo počet přesně identifikovaných fosforylačních míst na celkových 52. Klíčová slova: samčí gametofyt, zralý...
|
|
|
Využití biotechnologických metod při pěstování technického konopí (Cannabis sativa L.)
Širl, Marek ; Zelenková, Sylva (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
Konopí seté (Cannabis sativa L.) je všestranně využitelná rostlina, která poskytuje vlákno, celulózu a pazdeří pro průmyslové zpracování, biomasu pro energetické využití a produkuje sekundární metabolity využitelné ve farmaceutickém průmyslu. Pro svoji odolnost vůči stresům a schopnosti akumulovat těžké kovy má potenciální využití i pro fytoremediace. V současné době je snaha získat a odvodit genotypy konopí se specificky vylepšenými vlastnostmi, rozšiřující možnosti jeho uplatnění, nejen pomocí klasického šlechtění, ale zejména transgenozí. Cílem současného výzkumu je proto nalézt optimalizované podmínky, umožňující efektivní kultivaci in vitro, jako základní předpoklad genetické transformace. Vhodnou metodou transformace konopí je kokultivace s Agrobacteriem tumefaciens.
|
|
|
Využití rostlin při přípravě vakcín proti lidskému papillomaviru
Dlabalová, Lucie ; Moravec, Tomáš (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
Papillomaviry způsobují různá onemocnění od kožních bradavic až po léze vedoucí ke vzniku maligních nádorů. Mezi lidmi jsou velice rozšířeny. Proto se v současnosti vyvíjí metody produkce levných a účinných vakcín jak pro jejich prevenci tak i terapii nádorů. V současnosti jsou k produkci farmaceutik nejčastěji používány živočišné a mikrobiální expresní systémy, které mají mnoho nevýhod a v budoucnu nemohou pokrýt poptávku. Otevírá se tak možnost využití rostlin jako potenciálně velmi efektivních producentů léčiv. Rostlinné expresní systémy se optimalizují a dochází ke zvyšování výtěžků, intenzivně se hledají cesty jejich nejlepšího a nejbezpečnějšího způsobu využití. Tato práce shrnuje a porovnává výhody a nevýhody různých způsobů transformací rostlin, vedoucí buď ke stabilní produkci požadovaného proteinu v transgenních rostlinách, nebo přechodné expresi prostřednictvím rekombinantního rostlinného viru infikujícího netransgenní rostliny. Dále hledá nejvhodnější rostlinné druhy, poskytující vysoké výtěžky ve spojení s určitou transformační metodou a umožňující snadný způsob pěstování, popisuje několik základních způsobů optimalizací exprese a nastiňuje budoucnost rostlinných expresních systémů.
|
|
|
Praktické využití geneticky modifikovaných rostlin
Říhová, Barbora ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Cvrčková, Fatima (oponent)
Genetické inženýrství (GI) rostlin je téma velice aktuální, a stále více kontroverzní, neboť se stává neodmyslitelnou součástí života nás všech. GI má, kromě jiného, velký potenciál pomoci vyřešit aktuální otázku hladu a podvýživy v určitých částech světa. Tato práce má za cíl objasnit, co jsou geneticky modifikované (GM) rostliny, představit možnosti praktického využití GM rostlin, způsoby přípravy a zvážit jejich výhody a případná rizika. GM rostlinou rozumíme rostlinu, které byla cíleně změněna genetická informace vnesením či vyjmutím části genetické informace (úseku DNA, zpravidla genu). Nejvíce používané metody transformace jsou transformace pomocí Agrobacteria tumefaciens a balistickou metodou. GM rostliny se mohou využívat pro produkci potravin a krmiv v lepší kvalitě a větší kvantitě, díky navozené vyšší odolnosti, ať už vůči stresu biotickému (vůči napadení škůdcem, virem, bakterií..), tak vůči abiotickému (sucho, salinita, toxické látky v půdě,..). Zejména odolnost vůči abiotickému stresu je aktuální problém, neboť díky měnícím se klimatickým podmínkám některé regiony stále více trpí nedostatkem srážek a následným suchem. Některé GM rostliny pěstované pro produkci potravin také mají lepší nutriční vlastnosti, což může pomoci vyřešit problém s nedostatkem určitých složek potravy v zemích třetího...
|
|
|
Variabilita exprese a umlčování transgenů v rostlinách bramboru a v buněčné linii tabáku BY-2
Nocarová, Eva ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent) ; Kovařík, Aleš (oponent)
Závěry U suspenzních kultur buněčné linie tabáku BY-2 odvozených z kalusů po transformaci bylo po transformaci téměř 90 % linií tvořeno buňkami s různou mírou fluorescence GFP. Nově zavedená metoda klonování umožnila získání téměř poloviny klonů s homogenní expresí GFP z primárně heterogenních linií BY-2. Heterogenita exprese GFP u transgenních linií BY-2 měla původ jednak genetický (primární linie obsahovaly buňky s různými inzercemi T-DNA) a jednak epigenetický. Epigenetická heterogenita linií BY-2 souvisela s umlčováním transgenů, tvorbou stabilních epigenetických stavů brzy po transformaci a "permanentní heterogenitou" projevující se kolísavými změnami v expresi GFP. Snížení nebo umlčení exprese transgenů u bramboru bylo pozorováno přednostně u linií s vyšším počtem insercí T-DNA a s vyšší počáteční expresí GFP. Umlčení vždy postupně postihlo oba vnesené geny, přičemž vymizení exprese GFP předcházelo (v řádu měsíců) ve všech sledovaných případech ztrátě rezistence ke kanamycinu (umlčení genu NPTII), což naznačuje vzájemné propojení mezi umlčováním obou transgenů. Stejná posloupnost v umlčení obou transgenů byla také pozorována u umlčených linií po obnovení exprese transgenů 5-azacytidinem, který způsobuje demetylaci DNA. Byl navržen možný mechanismus postupného umlčování transgenů v rámci celých rostlin...
|
|
|
Úloha mangan-stabilizujícího proteinu fotosystému II
Duchoslav, Miloš ; Rothová, Olga (oponent) ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce)
Miloš Duchoslav Úloha mangan-stabilizujícího proteinu fotosystému II Abstrakt Vznik oxygenní fotosyntézy byl jedním z klíčových momentů evoluce života na Zemi. Veškerý molekulární kyslík v atmosféře pravděpodobně vznikl štěpením vody, které probíhá v centru vyvíjejícím kyslík na fotosystému II. Fotosystém II, složitý komplex mnoha proteinů a kofaktorů, jehož struktura je do velké míry fylogeneticky konzervovaná, se nachází v thylakoidních membránách chloroplastů a sinic. Ač je mechanismus fotosyntetického rozkladu vody, probíhajícího na manganovém klastru, intenzivně zkoumán, není do dnešní doby uspokojivě objasněn. Podstatný vliv na stabilizaci manganového klastru a účinnost rozkladu vody mají vnější proteiny fotosystému II nacházející se v luminu thylakoidů. Nejdůležitější z nich je mangan-stabilizující protein (MSP), který je přítomný ve všech známých oxyfototrofních organismech. V literatuře je tomuto proteinu připisováno velké množství úloh - kromě stabilizace manganového klastru například také karbonátdehydratázová aktivita, GTPázová aktivita či regulace výměny poškozeného proteinu D1. Funkce MSP jsou pravděpodobně řízeny změnami v jeho dynamické struktuře. MSP se pravděpodobně podílí na regulaci fotosyntézy za různých vnějších a vnitřních podmínek. Předložená práce shrnuje současné znalosti o...
|
|
|
RNA interference u rostlin
Čermák, Vojtěch ; Kulich, Ivan (oponent) ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce)
RNA interference je jedním z dějů, které umožňují v buňkách regulovat aktivitu genů. Tento proces je většinou spouštěn přítomností dvoušroubovicové RNA v buňce. Z takovéto RNA mohou být vyštěpovány duplexy malých RNA, většinou o délce 20-25 nukleotidů, za pomoci proteinu zvaného Dicer. Jednovláknové malé RNA uvolněné z těchto duplexů jsou základním kamenem RNA interference a lze je třídit do několika skupin na základě jejich biogeneze. U rostlin se setkáváme s miRNA a siRNA. Malé RNA asociují s proteinem zvaným Argonaut a navádějí jej na základě sekvenční komplementarity k cílové molekule. Argonaut může fungovat buďto sám nebo v komplexu s jinými proteiny. V závislosti na charakteru proteinů účastnících se tohoto děje spouští malé RNA různorodé procesy, které mohou vést ke štěpení mRNA (proces, na který stačí samotný komplex Argonaut a malá RNA), blokování translace nebo modifikacím chromatinu. S RNA interferencí se lze setkat u většiny Eukaryot, kde hraje roli ve vývoji organismů, jejich reakci na stres, úpravách chromatinu a také v obraně proti virům. U rostlin se setkáváme s rozmanitou škálou mechanismů, kterými může RNAi fungovat a kterým začínáme teprve postupně rozumět a doceňovat jejich význam.
|
host ::
RSS.