|
|
Role WSS1 proteasy v DNA reparačních procesech kvasinkové buňky.
Adámek, Michael ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Zachování integrity DNA je v průběhu života kritické pro každý živý organismus. Organismy si proto vyvinuly mnoho způsobů, jak detekovat a opravit různé typy poškození DNA, způsobené endogenními i exogenními vlivy, vyúsťující dále v replikační stres. Chyby v těchto opravných mechanismech mohou vést k závažným lidským onemocněním, jako jsou neurologické poruchy, familiární druhy onkologických onemocnění nebo vývojové syndromy. V této diplomové práci byla zkoumána funkce kvasinkového proteinu Wss1, metaloproteasy, která se podílí na nedávno objevené DNA opravné dráze, která proteolyticky odstraňuje proteiny kovalentně zachycené na zuje silnou negativní interakci s jinou proteasou opravující DNA, Ddi1, přičemž bylo objeveno, že kvasinkový kmen postrádající současně geny je hypersenzitivní na hydroxyureu. Hydroxyurea inhibuje ribonukleotidreduktasu, čímž v konečném důsledk způsobuje zastavení buňky v fázi buněčného cyklu. V rámci této diplomové práce byly na základě předchozích studií provedeny tzv. "rescue" experimenty s různými variantami Wss1, postrádajícími jednotlivé domény či obsahujícími bodové aminokyselinové záměny. Tyto experimenty následně posloužily k posouzení účasti jednotlivých domén proteinu Wss1 v odpovědi na replikační stres vyvolaný hydroxymočovinou.
|
|
|
The relationship between splicing and posttranslational modifications of chromatin in Saccharomyces cerevisiae
Kovaľová, Libuša ; Folk, Petr (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Protein Prp45, kvasinkový ortholog lidského transkripčního koregulátoru SNW1/SKIP, byl v literatuře doposud spojován pouze s regulací sestřihu pre-mRNA. Naše laboratoř odhalila, že protein Prp45 geneticky interaguje nejen s proteiny zahrnutými v sestřihu pre-mRNA, ale také s faktory důležitými pro elongaci transkripce a enzymy katalyzujícími chromatínové modifikace. Naše výsledky a rovněž i poznatky o lidském orthologovi SNW1/SKIP naznačují, že by Prp45 mohl sloužit jako regulátor propojující sestřih, transkripci a stav chromatínu u S. cerevisiae. Hlavním cílem diplomového projektu bylo zjistit, zda protein Prp45, který je nezbytný pro kotranskripční sestavování spliceozomu, ovlivňuje posttranslačné modifikace chromatínu na transkribovaných genech. Pomocí chromatinové imunoprecipitace nicméně nebyl potvrzen vliv mutace prp45(1-169) na profil trimethylace histonu H3 na lyzinu 4 a acetylace histonu H3 na lyzínech 9, 14 a 18 na lokusech transkripčně aktívních genů. Naším cílem také bylo průtokovou cytometrií analyzovat chování buněk synchronizovaných pomocí α-faktoru. Bylo ukázáno, že mutace prp45(1-169) vede k prodloužení buněčného cyklu. V rámci diplomového projektu byl pro účely sledování dynamiky nukleozomů v kmenech S. cerevisiae zaveden systém indukované exprese značeného histonu H3. Výsledky...
|
|
|
Oxidativní stres u bakterií - s důrazem na modelový organismus Escherichia coli
Moravcová, Andrea ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Většina bakteriálních druhů se během svého života setká s aerobními podmínkami, které pro ně mohou být toxické. Tím se dostávají do stavu oxidativního stresu. Toxicita aerobního prostředí vyplývá z chemických vlastností molekulárního kyslíku a jeho reaktivních druhů (ROS). Aby si bakterie zajistily přežití a prosperitu, musely se těmto podmínkám v minulosti přizpůsobit. Tato práce se přednostně věnuje oxidativně stresovým adaptacím u nejprostudovanějšího bakteriálního modelu - Escherichia coli. Jsou zde popsány adaptace na úrovni regulace transkripce, translace i metabolismu s důrazem na molekulární mechanismy. Hlavním adaptačním mechanismem proti oxidativnímu stresu je jednak deaktivace ROS, dále pak oprava poškozených struktur (makromolekul). Tyto enzymové aktivity jsou regulovány globálně několika transkripčními regulátory. Velmi dobře jsou prostudovány transkripční regulátory OxyR a SoxRS u E. coli. Tyto regulátory jsou konzervovány napříč bakteriálním spektrem, což ale neznamená, že u všech organismů zastávají stejnou funkci. To je důvod, proč byly do této práce zahrnuty i jiné více či méně prostudované bakterie - Bacillus subtilis, Streptomyces coelicolor, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa - a představen jejich způsob využití nejen těchto, ale i jiných, pro tyto bakterie...
|
|
|
CRISPR/Cas9-based genome editing in mice: state of the art and future perspectives
Eliáš, Jan ; Kašpárek, Petr (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Mutantní myši jsou klíčové pro odhalení funkce genů in vivo. V posledních letech prošla jejich příprava revolucí díky rychlému rozvoji programovatelných nukleáz, především systému CRISPR/Cas9. Editace genomu založená na vnesení komponentů systému CRISPR/Cas9 do časných vývojových stádií myších embryí umožnila rychlou a levnou přípravu genově deficientních myších modelů, hlavně ve srovnání s tradičními metodami, založenými na modifikacích embryonálních kmenových buněk (ESCs). Schopnost systému CRISPR/Cas9 indukovat na daném místě v genomické DNA dvojvláknový zlom (DSB) umožňuje efektivní narušení správného fungování daného genu díky náhodným mutacím dané sekvence, nebo kompletním vyštěpením daného genu. Přesné modifikace, jako inkorporace fragmentu DNA do daného lokusu, nicméně pořád zůstávají obtížně proveditelné. V této práci shrnuji systém CRISPR/Cas9, jeho použití v produkci mutantních myší a jeho možné modifikace, které by vedly ke zvýšení účinnosti přesných modifikací. Klíčová slova: CRISPR/Cas9, myš, transgeneze, homologní rekombinace
|
|
| |
|
|
Reflection of Carl von Clausewitz's work in anglo-american military historiography
Cáp, Michal ; Šedivý, Ivan (vedoucí práce) ; Beneš, Zdeněk (oponent)
Táto bakalárska práca sa zaoberá reflexiou diela Carla von Clausewitza v anglo- americkej vojenskej historiografii. Dielo Carla von Clausewitza O vojne, je obecne považované za jednu z najvýznamnejších a najznámejších kníh venujúcich sa problematike ozbrojeného konfliktu. Preto bolo vybrané ako jav, prostredníctvom ktorého je sledovaný vývoj a transformácie anglo-americkej vojenskej historiografie. V prvej časti tejto práce je popísaná problematika vojenských dejín obecne a odkaz Carla von Clausewitza špecificky. V druhej časti sú získané poznatky aplikované na historiografický prehľad.
|
|
|
Charakterizace vazby transkripčních faktorů CSL na DNA v kvasince Schizosaccharomyces pombe
Jordáková, Anna ; Převorovský, Martin (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Proteiny Cbf11 a Cbf12, patřící do rodiny transkripčních faktorů CSL, jsou u poltivé kvasinky Schizosaccharomyces pombe zapojeny v široké škále buněčných procesů - mj. regulují buněčnou adhezi a podílejí se na udržování integrity genomu. V rámci celého genomu jsme již dříve identifikovali cílové lokusy, kam se proteiny CSL váží in vivo. Mnoho z cílových míst neobsahuje konsenzuální CSL-vazebný element. Patrně existují různé režimy vazby proteinů Cbf11/12 na DNA a doposud nebylo známo, s jakou biologickou funkcí je způsob vazby na DNA spojen. Pro účely studia DNA-vazebných módů proteinů CSL jsme v rámci tohoto projektu pracovali na zavedení DNA-vazebné mutace (DBM), která způsobuje ztrátu schopnosti proteinů CSL se vázat na kanonický motiv in vitro, do chromozomálního lokusu genů cbf11 a cbf12. S použitím "ura4 selekčního systému" jsme úspěšně zkonstruovali kmeny Cbf12-TAP a Cbf12DBM-TAP, tj. kmeny bez/s DBM v otevřeném čtecím rámci Cbf12, ve kterých je navíc protein Cbf12 C-terminálně značen TAP-tagem a obsahuje intaktní oblast 3'UTR. Nově jsme v naší laboratoři zavedli CRISPR/Cas9 systém, s využitím kterého se nám podařilo připravit kmen Cbf11-TAP. S konstrukcí kmene Cbf11DBM-TAP jsme prozatím neuspěli, nicméně v rámci práce diskutujeme možné optimalizace konstrukčního postupu, které by mohly vést...
|
|
|
The Role of DNA Repair in the Onset and Therapy of Ovarian Cancer
Tomášová, Kristýna ; Vodička, Pavel (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Detekce poškození DNA a její oprava jsou důležité biologické systémy, které chrání genetickou informaci před změnami a přispívají tak k celkové stabilitě genomu. Jelikož je mnoho látek užívaných v boji proti rakovině založených na vyvolávání DNA poškození, podílí se mechanizmus oprav DNA významnou měrou i na léčebné odezvě organizmu na chemoterapii. Cílem této práce je uceleně shrnout problematiku vzniku rakoviny vaječníků ve vztahu k opravě DNA. Zvláštní důraz je přitom kladen na poruchy jednotlivých reparačních drah, které jsou neoddělitelně spjaty se vznikem rakoviny i úspěšností její léčby. Kromě nejznámějších genových mutací souvisejích s rakovinou vaječníků, jako jsou BRCA1 a BRCA2 účastnící se homologní rekombinace, bude značný prostor věnován i méně známým mutacím. Nejčastějším důvodem vzniku rakoviny vaječníků jsou dle výzkumů poruchy funkce proteinů uplatňujících se v opravách DNA homologní rekombinací. Výzkumy rovněž ukazují, že cílená inhibice či poškození opravných drah DNA, zejména bázových excizních oprav, mohou napomáhat efektivnímu působení chemoterapie. To platí i pro nukleotidové excizní opravy, které odstraňují adukty platinových komplexů na DNA a napomáhají tak k ustanovení rezistence vůči platinovým cytostatikům. Mechanimus korekce správného párování bazí je u ovariálního...
|
|
|
Zavedení nových metod pro studium molekulárně genetické podstaty onemocnění CADASIL
Hrubá, Monika ; Vlášková, Hana (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
CADASIL je autozomálně dominantně dědičné neurodegenerativní onemocnění s pozdním nástupem charakterizované poškozením malých cév, podkorovými infarkty a poškozením bílé hmoty mozkové. Nejčastějšími příznaky jsou migrény s aurou, cévní mozkové příhody, zhoršení kognitivních funkcí a demence. Onemocnění je způsobeno mutacemi v genu NOTCH3, převážně jde o jednonukleotidové záměny měnící počet cysteinových zbytků v EGF- like repeticích proteinu Notch3. V České republice se pro analýzu molekulárně genetických příčin tohoto onemocnění užívají metody Sangerova sekvenování PCR produktů a MLPA. U některých pacientů s podezřením na CADASIL se však těmito metodami nepodařilo diagnózu potvrdit. Proto bylo cílem této práce zavést metodu analýzy transkriptu Sangerovým sekvenováním PCR produktů cDNA a metodu kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR) pro zjištění velkých delecí/duplikací. Analýzou transkriptu byla experimentálně potvrzena existence transkripční varianty X1 u zdravých kontrol a bylo prokázáno, že varianta c.1725G>A (p.T575=) má vliv na sestřih. Chybným sestřihem dochází k deleci zahrnující cysteinové zbytky, a tak může tato varianta způsobovat onemocnění CADASIL. U dalších testovaných variant nebyly nalezeny změny na úrovni transkriptu. Metoda qPCR neprokázala při použití v této práci dostatečnou...
|
|
|
Bakteriofágy - současné poznatky a možnosti jejich terapeutického využití
Glendová, Kristýna ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Bakteriofágy, jako viry bakterií, jsou nejrozšířenější organismy, které osidlují všechny biotopy, v nichž se nachází i bakterie. Jednou z alternativ boje proti infekcím, způsobených rezistentními kmeny bakterií, se v současné době jeví bakteriofágová terapie, která spočívá v aplikaci lytických bakteriofágů, či pouze bakteriofágových enzymů k potlačení růstu bakterií. Práce zmiňuje historii fágové terapie, stěžejní část práce se zabývá shrnutím současných trendů v bakteriofágové terapii, která se začíná rozvíjet v posledních letech. Mnoho studií se věnuje možnostem léčby bakteriálních infekcí fágovými lyzáty, včetně geneticky modifikovaných bakteriofágů a dále možnosti použití samotných bakteriofágových enzymů - endolysinů, či kombinaci fágových lyzátů a endolysinů s antibiotiky. Hlavními zájmy ve studiích jsou účinnost, specifita a bezpečnost terapie. Účinnost bakteriofágové terapie byla prokázána mnoha studiemi, jak in vitro, tak i in vivo. Bezpečnost terapie pro využití v klinické praxi se ale musí potvrdit stále málo prozkoumanými in vivo experimenty. Klíčová slova: bakteriofágy, bakteriofágová terapie, endolysiny, enzybiotika, multirezistence,
|
host ::
RSS.