|
|
Úloha vybraných podjednotek komplexu exocyst ve vývoji epidermis Arabidopsis.
Vojtíková, Zdeňka ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Soukup, Aleš (oponent)
Exocyst je bílkovinný komplex, evolučně konzervovaný u kvasinek, živočichů i rostlin, který hraje roli v řízení buněčné morfogeneze a polarity. Jedná se o poutací komplex, jehož funkcí je navázat sekretorický váček na správné místo na plazmatické membráně. Komplex exocyst je tvořen osmi podjednotkami. Podjednotka EXO70 je v genomu Arabidopsis thaliana kódována 23 paralogními geny. Mutace v paralogní podjednotce EXO70H4 způsobuje defekt ve fázi zrání trichomů. Mutantní trichomy mají slabou, nezesílenou buněčnou stěnu, díky čemuž jsou trichomy měkké a ohebné. Transkripce genu EXO70H4 je indukována UV zářením a proto byla provedena také pozorování rostlin pěstovaných na UV-B záření. Analýza mutantů pěstovaných na UV-B záření odhalila v cytoplazmě hyperakumulaci váčků pozorovatelných světelným mikroskopem. U kontrolních rostlin pěstovaných na UV-B záření k hyperakumulaci váčků nedocházelo, ale bylo indukováno tloustnutí buněčné stěny, které dosud nebylo jako reakce na UV u trichomů nikde popsáno. Analýza buněčné lokalizace pomocí YFP značených konstruktů ukázala, že EXO70H4 lokalizuje do mobilních tělísek asociujících s Golgiho aparátem. Pomocí dvouhybridního kvasinkového systému bylo zjištěno, že EXO70H4 interaguje s TRS120, podjednotkou jiného poutacího komplexu TRAPPII aktivního na Golgiho aparátu....
|
|
|
Dynamika plasmatické membrány a tonoplastu při zavírání a otevírání průduchů.
Röder, Matěj ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Albrechtová, Jana (oponent)
Průduchy jsou struktury v pokožce rostlin zajišťující svou průduchovou štěrbinou regulovaný kontakt apoplastického prostoru rostliny s okolím. Zásadní úlohu pro zahájení otevření či zavření průduchu hraje změna turgoru ve svěracích buňkách. Během stomatálních pohybů prodělává svěrací buňka značné a opakované změny svého objemu, a tedy i povrchu, v rámci minut. Protože cytoplazmatická membrána má pouze malou roztažitelnost, tak tato změna musí být doprovázena i změnou povrchu membrány. Ta se může dít pomocí membránových vchlípenin a endocytózy membránových váčků. Pomocí elektrofyziologických a mikroskopických technik bylo dokázáno, že oba procesy se ve svěracích buňkách reálně dějí. Tyto procesy jsou ovládány a regulovány komplexní sítí signálních drah, v nichž důležitou roli hraje aktinový i mikrotubulární cytoskelet, proteiny z nadrodiny SNARE, iontové kanály a další molekuly. Cílem této práce je sumarizovat současné znalosti o procesech a mechanismech těchto změn membránových povrchů a jejich molekulovou podstatu.
|
|
|
Funkční charakterizace podjednotky Sec5 komplexu exocyst u rostlin.
Sekereš, Juraj ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent)
Exocyst je proteinový complex hrající roli v sekretorické dráze eukaryotických buněk. K plasmatické membráně připoutává váčky, které následně s membránou splynou díky aktivitě SNARE proteinů. V současnosti je jeho funkce studována u kvasinek, živočichů, ale i u rostlin. Tato práce se zabývá studiem podjednotky komplexu Sec5 u modelového rostlinného organismu Arabidopsis thaliana. Lokalizace a dynamika tohoto proteinu značeného fluorescenčním proteinem GFP byla studováne na vnitrobuněčné úrovni pomocí mikroskopie, včetně metody VAEM/TIRF. Sec5 je protein lokalizován v cytoplasmě buněk kořene. Protein se také vyskytuje na cytoplasmatické membráně buněk s vysokou sekreční aktivitou a ve zrajících přepážkách v pozdějších fázích buněčného dělení. Doplňování proteinu na membránu částečně závisí na aktinovém cytoskeletu. Závěry práce se shodují s poznatky o dalších podjednotkách komplexu exocyst organismu Arabidopsis thaliana, které byly získány podobnými metodami. Práce přináší výsledky, které spolu s předchozími poukazují na funkci proteinu Sec5 v rámci komplexu exocyst.
|
|
|
Kortikální cytoskelet, exocytický komplex exocyst a jejich role v morfogenzi rostlinných buněk
Fendrych, Matyáš ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Baluška, František (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
Morfogeneze rostlinných buněk úzce souvisí s koordinací plasmatické membrány, cytoskeletu a exocytózy. Forminy jsou proteiny regulující tvorbu vláken aktinového cytoskeletu. Rostlinné forminy náležející do třídy I jsou integrální membránové proteiny, mohou tedy regulovat dynamiku cytoskeletu z pozice membránového proteinu. Zjistili jsme, že formin AtFH4 z Arabidopsis thaliana se váže na mikrotubulární cytoskelet. Doména zodpovědná za tuto vazbu se nachází mezi transmembránovou a "formin homology 1" doménou. V in vitro podmínkách vázal AtFH4 protein aktinová vlákna. AtFH4 se lokalizoval do membrán endoplasmatického retikula, když byl overexprimován v buňkách tabáku. Zároveň tato lokalizace způsobila rozmístění membrán endoplasmatického retikula podél mikrotubulárního cytoskeletu. Z těchto výsledků vyvozujeme, že AtFH4 je schopný být současně umístěn v membráně a svoji vazbou na aktin a mikrotubuly propojovat tyto dva typy cytoskeletu. Rostlinná cytokineze závisí na sekretorické dráze; na exocytóze i endocytóze. Před tím, než sekretorické váčky splynou s plasmatickou membránou, jsou k ní poutány "poutacím komplexem" zvaným exocyst, složeným z osmi podjednotek. Analyzovali jsme mutanty v jedné z podjednotek exocystu A. thaliana - EXO84b. Mutantní rostliny byly zakrslé, nejspíše kvůli porušené sekretorické...
|
|
|
The secretory vesicles tethering complex exocyst and the auxin transport polarization
Janková Drdová, Edita ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Baluška, František (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
U kvasinek a živočišných buněk se na polarizaci exocytózy významně podílí exocyst - oktamerní proteinový komplex, který je řízen pomocí Rab a Rho GTPáz. Nedávno byl exocyst popsán také jako funkční komplex podílející se na morfogenezi rostlin. Hála et al., (2008) objasnil zapojení tohoto komplexu do procesů růstu pylové láčky a elongace hypokotylu etiolovaných semenáčků, Fendrych et al., (2010) odhalil klíčovou roli exocystu při tvorbě nové buněčné přepážky, Kulich et al., (2010) podtrhl význam exocystu při tvorbě semenných obalů a Pečenková et al., (2011) popsala účast podjednotek exocystu v odpovědi rostliny k napadení patogenem. Všechny tyto procesy jsou úzce spjaty s polarizovanou sekrecí. Naše práce ukazuje zapojení exocystu v recyklaci auxinových přenašečů PIN. Přímým měřením auxinového transportu jsme ukázali, že transport auxinu ke špičce kořene mutanta exo70A1 je výrazně zpomalen. Na buněčné úrovni jsme odhalili akumulaci malého množství fúzního proteinu PIN2:GFP do kompartmentů odlišných od endosomů nesoucích VHAa1. Navíc byla v kořenech mutantů exo70A1 a sec8-m1 po působení brefeldinu A výrazně zpomalena recyklace fúzních proteinů PIN1:GFP a PIN2:GFP. Ještě výraznější recyklační defekt byl patrný po prodlouženém působení BFA. Tento přístup vyvolává transcytózu - tj. relokalizaci PIN proteinů z...
|
|
|
Exocyst subunit AtSEC15b: its role in plant cell morphogenesis and characterization of its Rab interacting partner
Toupalová, Hana ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Baluška, František (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
Organizace membránových kompartmentů v eukaryotních buňkách závisí na nepřetržitém transportu membránových váčků. Je známo, že velkou část klíčových regulátorů tohoto transportu představují malé GTPázy z rodiny Rab. Ty cyklují mezi GTP-vazebnou "aktivní" a GDP-vazebnou "neaktivní" formou. Ve své aktivní formě interagují se specifickými efektory a vykonávají tak svou funkci. Exocyst je osmipodjednotkový komplex, který se podílí na regulaci sekrece. Funguje jako efektor Rab GTPáz u kvasinek a savců, kde poutá sekreční váčky k plazmatické membráně před samotným splynutím membrán. S pomocí veřejně dostupných expresních dat jsme nalezli několik kandidátů z rodiny Rab GTPáz, kteří by mohli interagovat s podjednotkou AtSEC15b u rostlin a dokázali, že AtSEC15b specificky interaguje s AtRABA4a GTPázou. Dále jsme ukázali, že stejně jako u kvasinek a savců tato interakci pravděpodobně probíhá v závislosti na GTP-vazebné formě Rab GTPázy, což naznačuje, že je tato interakce zachována v rámci všech Eukaryot. Dále jsme úspěšně předvedli komplementaci teplotně-senzitivního kvasinkového mutanta sec15-1. Na základě tohoto pozorování jsme dospěli k závěru, že protein AtSEC15b je schopen funkčně nahradit kvasinkový protein Sec15 a tím obnovit normální fenotyp. Ko-lokalizační analýza odhalila přítomnost endosomům podobného...
|
|
|
Secretory pathway in plant cell wall polysaccharide biosynthesis and FT-IR spectroscopy methods in plant cell wall composition analysis
Glanc, Matouš ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Votrubová, Olga (oponent)
Všechny rostlinné buňky jsou obklopeny buněčnou stěnou, která ustavuje jejich velikost a tvar a je nezbytná pro mnoho zásadních buněčných procesů. Buněčná stěna streptofytních rostlin je tvořena převážně vysokomolekulárními polysacharidy. Celulóza, hlavní složka buněčné stěny rostlin, je syntetizována transmembránovými proteinovými komplexy přímo na povrchu buňky, zatímco hemicelulózy a pektiny jsou tvořeny v Golgiho aparátu. Bylo popsáno několik proteinů účastnících se syntézy těchto polysacharidů, nicméně stovky dalších teprve čekají na objevení. Proteiny nutné pro syntézu celulózy a molekuly hemicelulóz a pektinů syntetizované v Golgiho aparátu jsou transportovány na povrch buňky sekreční drahou, tato dráha tedy hraje důležitou roli v biogenezi buněčné stěny. Hypotézy o regulaci sekrece komponent buněčné stěny počítají s působením aktinového a mikrotubulárního cytoskeletu, vápníkového gradientu nebo PIP kináz; komplexní regulace tohoto procesu však zdaleka není popsána. FT-IR spektroskopie je metoda schopná detekce molekulárních vibrací, s jejíž pomocí je možné získat informace o chemickém složení prakticky všech látek. Tato metoda je úspěšně používána v identifikaci mutantů s abnormální buněčnou stěnou, ve studiu interakcí mezi jednotlivými složkami buněčné stěny a v dalších experimentech...
|
|
|
Mechanismy polarizace epidermálních buněk rostlin.
Vojtíková, Zdeňka ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Soukup, Aleš (oponent)
Buňky rostlinné epidermis společně vytváří kontaktní plochu rostliny a chrání ji před vlivy vnějšího prostředí a zprostředkovávají komunikaci s okolím. V epidermis je za pomoci polarizačních mechanismů rovnoměrně rozmístěno několik buněčných typů (dlaždicové buňky, trichomy a průduchy) s velice specializovanou morfologií. Svých tvarů dosáhnou díky polarizovanému růstu, který je zajištěn cytoskeletem a signalizačními molekulami z rodiny ROP GTPáz. Cytoskelet v odpovědi na signál ovlivňuje rozpínání buňky, napomáhá zacílit sekreci do míst aktivního růstu a polarizovaně zabudovávat nový materiál do buněčné stěny. Na svrchní straně epidermis se vylučuje kutikula a vrstva epikutikulárních vosků. Sekrece složek kutikulárních vrstev je baso-apikálně polarizovaná. V této práci jsou shrnuty doposud objevené mechanismy polarizace v buňkách epidermis rostlin.
|
|
|
The role of the exocyst in development and maintaining of cell migration structures
Vaškovičová, Katarína ; Žárský, Viktor (oponent) ; Brábek, Jan (vedoucí práce)
Exocyst je hetero-oktamérny proteínový komplex, ktorý sprostredkováva cielenie sekretorických vačkov na špecifické miesta plazmatickej membrány pre polarizovanú exocytózu. Dlho bolo známe, že exocyst je dôležitý v procesoch ako pučanie kvasiniek, cytokinéza, polarizácia epitélií a vetvenie neuritov. Nedávno sa však ukázalo, že exocyst hrá rolu aj v regulácii aktínového cytoskeletu a v bunkovej migrácii. Exocyst je dôležitý pre tvorbu štruktúr, ktoré bunka tvorí, aby mohla migrovať. Takýmito štruktúrami sú lamelipódiá a filopódiá v pohyblivých bunkách a invadopódiá v invazívnych rakovinových bunkách. Všetky tieto štruktúry sú výčnelky plazmatickej membrány a ich základom sú aktínové vlákna. Podjednotka exocystu Exo70 interaguje s Arp2/3 komplexom, ktorý katalyzuje vetvenie aktínových filamentov. Väzbou a aktivovaním Arp2/3 komplexu exocyst sprostredkováva polymerizáciu aktínu, ktorá má za následok tvorbu vyššie spomínaných membránových výbežkov. Exocyst tiež sprostredkováva špecifickú lokalizáciu Arp2/3 komplexu na miesta, ktoré sa majú stať membránovými výčnelkami. Ďalšou úlohou exocystu je sekrécia matrixových metalloproteáz (MMPs), ktoré degradujú extracelulárnu matrix, čo je proces nevyhnutný v invazivite nádorových buniek. Exocyst je súčasťou signálnej kaskády vedúcej od cytokínov TNF-α a IL-1...
|
|
| |
host ::
RSS.