|
| |
|
|
Localization and characterization of binding sites for Ca2+ binding proteins and phosphatidylinositol phosphates on intracellular termini of TRP channels
Boušová, Kristýna ; Teisinger, Jan (vedoucí práce) ; Žáčková, Markéta (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Tato disertační práce pojednává o charakterizaci vazebných míst pro kalcium vázající protein S100A1 a fosfatidylinositol fosfáty na intracelulárních koncích transient receptor potential (TRP) kanálů, a to především z rodin kanonických (TRPC), vaniloidních (TRPV) a melastatinových (TRPM). TRP kanály reprezentují superrodinu důležitých zprostředkovatelů dějů, které se odehrávají především v oblasti senzorické physiologie: přispívají k detekci chuti, rovnováhy těla, zraku, sluchu, hmatu a k sensibilitě vůči teplotním a tlakovým vjemům vnějšího prostředí. Tyto kanály slouží jako specializované neselektivní a nociceptivní membránové receptory zodpovědné za modulaci sil, které řídí vstup kationtů do buňky. TRP kanály jsou tvořeny šesti transmembránovými doménami s N- a C- terminálními konci vyskytujícími se v intracelulární oblasti. Celkem čtyři monomerní jednotky tvoří charakteristické uspořádání funkčního kanálu. Bylo prokázáno, že většina členů této téměř třicetičlenné rodiny transportérů je aktivována různorodými stimuly působícími jako signální integrátory. Z nejvíce prozkoumaných intracelulárních modulátorů TRP kanálů jsou cytosolické kalcium vázající proteiny a fosfatidylinositol fosfáty (PIPs) ukotvené na vnější straně cytoplazmatické membrány. Tyto signální integrátory váží specifické domény v...
|
|
|
Studium membránových transportních procesů u kvasinek pomocí potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3)
Bartl, Tomáš ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Název práce: Studium membránových transportních procesů u kvasinek pomocí potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3) Autor: Tomáš Bartl Katedra / Ústav: Fyzikální ústav UK Vedoucí bakalářské práce: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc., Fyzikální ústav UK Abstrakt: V membránách kvasinek existuje celá řada transportérů. Některé jsou zodpovědné za přísun živin do buněk, jiné za vylučování odpadních a cizorodých látek ven z buněk nebo za transport malých anorganických iontů a protonů přes membránu. V této práci byla studována činnost specifických transportních proteinů, tzv. MDR pump, které jsou zodpovědné za odstraňování cizorodých látek/léků z buněk. Pomocí série mutantních kmenů kvasinek Saccharomyces cerevisiae (AD12, AD1-3 a AD1-8) lišících se zastoupením jednotlivých MDR pump v jejich plazmatické membráně byl zkoumán vliv různých chemických látek na změnu intracelulární koncentrace potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3), která je aktivně odstraňována z buněk některými z těchto pump. Sledováním účinku glukózy a 2-deoxyglukózy byl prokázán aktivní příspěvek nejenom hlavní MDR pumpy, Pdr5p, ale také dalších pump ke snižování intracelulární koncentrace sondy. Bylo zjištěno, že zatímco glukóza zvyšuje aktivitu těchto pump při odstraňování sondy z cytosolu, přidání 2-deoxyglukózy způsobuje naopak jejich...
|
|
| |
|
|
Calcium homeostasis and modulation of nociceptive synaptic transmission
Sojka, David ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Žurmanová, Jitka (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
3 transient induced by control dorsal root stimulation. Using this model together with transgenic labeling of specific neuronal populations could be useful in the future, especially for pharmacological testing of new analgesic drugs. SOUHRN PRÁCE Předkládaná disertační práce má za cíl přispět k objasnění míšních mechanismů nocicepce. Jedním z důležitých mechanismů podílejících se na vzniku a průběhu řady chronických bolestivých stavů je tzv. centrální sensitizace. Jedná se o formu dlouhodobé modulace synaptického přenosu na míšní úrovni, neboli synaptické plasticity. Tato studie se ve své hlavní části zabývá vývojem metody, která by s využitím techniky Ca imagingu umožnila studovat mechanismy centrální sensitizace in vitro na populaci neuronů zadního míšního rohu. V pokusech provedených na akutních míšních řezech jsme snímali změny fluorescence u Ca-senzitivní sondy FLUO-4 v neuronech zadního míšního rohu. Analýza změn intracelulární koncentrace Ca, ke kterým docházelo během synaptického přenosu vyvolaného stimulací zadního kořene míšního, odhalila dva odlišné typy Ca odpovědí. První typ odpovědi byl synchronizovaný s elektrickou stimulací, zatímco druhý typ, odpovídající uvolnění Ca z vnitřních Ca zdrojů, následoval po určité časové prodlevě po stimulaci. Tyto pozdní Ca odpovědi, nezávislé na aktivaci...
|
|
|
Study of factors influencing the function of MntH, membrane transport protein of E. coli
Jurková, Ingrid ; Urbánková, Eva (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Protein MntH patřící do rodiny transportérů Nramp hraje důležitou roli nejen v homeostáze železa a manganu, ale i při obraně bakteriálních buněk před imunitní reakcí napadeného hostitele. Tento protein transportuje do buňky dvojmocné kovové ionty v symportu s protony, přičemž stechiometrie tohoto transportu se mění v závislosti na membránovém potenciálu a na extracelulárním pH. V první části této práce byl pomocí redistribuční potenciálové sondy diS-C3(3) zkoumán vliv exprese MNTH a transportu dvojmocných iontů přenašečem MntH na membránový potenciál buněk E. coli. Zjistili jsme, že buňky exprimující MNTH jsou hyperpolarizovány a jejich membránový potenciál se depolarizuje po přidání některých dvojmocných kovů. Ve druhé části práce jsme se věnovali teoretickému studiu kinetiky membránových přenašečů popsaných čtyř-, šesti- nebo osmistavovým transportním modelem, do něhož byla zavedena závislost všech rychlostních konstant na membránovém potenciálu. Pomocí matematického modelování byla zkoumána závislost toku přenašečem na různých parametrech transportního modelu, jako jsou například membránový potenciál, koncentrace substrátu nebo náboj substrátu či přenašeče. Byly pozorovány některé jevy, popisované i u proteinu MntH (proměnná stechiometrie transportu a její závislost na potenciálu a pH). Pro detailnější...
|
|
| |
|
|
Analýza uspořádaní vazebné kapsy MDR pumpy Cdr1p patogenní kvasinky Candida albicans - hlavního přispěvatele ke klinické lékové rezistenci
Bartl, Tomáš ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Název práce: Analýza uspořádaní vazebné kapsy MDR pumpy Cdr1p patogenní kvasinky Candida albicans - hlavního přispěvatele ke klinické lékové rezistenci Autor: Tomáš Bartl Katedra / Ústav: Fyzikální ústav UK Vedoucí diplomové práce: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc., Fyzikální ústav UK Abstrakt: Kandidózové infekce jsou častou příčinou úmrtí hospitalizovaných pacientů. U nejvýznamnějšího kvasinkového patogenu, Candida albicans, je za jeho klinicky významnou rezistenci vůči používaným lékům (azolům) zodpovědná nadprodukce proteinů transportních pump, které léčivé látky odstraňují z buněk, a vzniká tak fenomén mnohačetné lékové rezistence - MDR. Cílem této práce bylo ověřit vhodnost použití kmenů kvasinky Saccharomyces cerevisiae využívajících heterologní expresi MDR pump z patogenní kvasinky Candida albicans, a na tomto systému potvrdit výsledky získané přímo na C. albicans s homologní expresí. Skutečnost, že azolová léčiva mikonazol, bifonazol a ketokonazol, a potenciometrická fluorescenční sonda diS-C3(3), jsou substráty pump CaCdr1p a CaCdr2p, ale nikoliv, nebo minimálně, pumpy CaMdr1p, tedy odpovídají dříve publikovaným výsledkům. Za pomoci jednak zónových testů, jednak diS-C3(3) fluorescenční metody, byla studována vazebná kapsa CaCdr1p s využitím strukturně podobných látek vorikonazolu, flukonazolu,...
|
|
|
Functional characterization of MDR pump Pdr5p responsible for multiple drug resistance in yeast Saccharomyces cerevisiae
Sayedová, Shirin ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Jedním z hlavních důvodů selhávání léčby infekcí způsobených patogenními mikroor- ganismy je nadměrná exprese membránových proteinů, které aktivně odstraňují léky z buněk, což vede k fenoménu zvanému mnohočetná léková rezistence MDR. V této práci jsme se zaměřili na funkční charakterizaci MDR pumpy Pdr5p u kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Ověřili jsme, že je možné použít dis-C3(3) fluorescenční metodu pro stanovení vazebných míst, do kterých se substráty vážou ve vazebné kapse pumpy ScPdr5p. Zaměřili jsme se na studium vazebné kapsy ScPdr5p pomocí triazolových derivátů: ravukonazolu, vorikonazolu a flukonazolu. Pomocí zónového testu jsme ukázali, že všechny tři studo- vané triazoly jsou substráty pumpy ScPdr5p. Zjistili jsme, že tyto strukturní analogy mají výrazně odlišný vliv na inhibici transportu potenciometrické fluorescenční sondy dis-C3(3) pumpou ScPdr5p, a také, že ravukonazol s vorikonazolem vzájemně kompetují o transport pumpou ScPdr5p. Využili jsme fluorescenční přístup ke studiu vazby azolů do vazebné kapsy pumpy ScPdr5p pomocí benchmark substrátů, které se vážou selek- tivně pouze do jednoho vazebného místa ve vazebné kapse pumpy ScPdr5p, a podpořili jsme tak hypotézu, že ravukonazol a vorikonazol se vážou do více než jednoho vazebného místa. 1
|
|
|
Studies on molecular interactions of the mu-opioid and TRPV1 receptors
Melkes, Barbora ; Novotný, Jiří (vedoucí práce) ; Blahoš, Jaroslav (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
V této práci jsme zkoumali chování -opioidního receptoru (MOR) a iontového kanálu TRPV1 (transient receptor potential vanilloid 1) v plazmatické membráně buněk a jejich vzájemnou komunikaci. Oba tyto receptory se podílejí na vnímání bolesti a analgezii. Zjistili jsme, že laterální pohyblivost MOR byla silně ovlivněna různými usměrňujícími opioidními agonisty. DAMGO a endomorfin-2 vykazují opačný usměrňovací agonismus vůči MOR. Podle našich výsledků mají také opačné účinky na mobilitu MOR. Morfin vyvolal pouze malé změny v mobilitě MOR. Kromě toho, deplece cholesterolu a blokování G proteinové signalizace za pomoci pertusového toxinu (PTX) ovlivňovaly schopnost agonistů MOR měnit jeho mobilitu. Účinky DAMGO a endomorfinu-2 byly za těchto podmínek sníženy. Na druhé straně jsme pozorovali morfinem zvýšený pohyb MOR po depleci cholesterolu. Samotný PTX neovlivnil pohyb receptoru, ale zcela narušil účinek deplece cholesterolu na morfinem vyvolanou změnu mobility MOR. Dále jsme se zabývali mobilitou TRPV1. Agonista TRPV1 kapsaicin změnil laterální mobilitu TRPV1. Překvapivě, po přidání MOR antagonisty naloxonu se také zvýšil difúzní koeficient TRPV1, ale v menší míře než po kapsaicinu. Agonista MOR DAMGO a antagonista levallorfan neovlivnily mobilitu TRPV1. Zjistili jsme, že kapsaicin i naloxon byly...
|
host ::
RSS.