|
| |
|
| |
|
|
The Intensive Care Unit-Acquired Weakness: the role of mitochondrial dysfunction in its pathogenesis
Jiroutková, Kateřina ; Duška, František (vedoucí práce) ; Houštěk, Josef (oponent) ; Maňák, Jan (oponent)
SOUHRN ÚVOD: Svalová slabost kriticky nemocných významně a dlouhodobě zhoršuje výkonnost a kvalitu života pacientů, kteří překonají závažné onemocnění nebo trauma. Protože specifická léčba dosud neexistuje, je výzkum její patogeneze velmi naléhavý. Hlavní rizikové faktory - sepse a syndrom systémové zánětlivé reakce - jsou sdruženy s mitochondriální dysfunkcí, proto bylo cílem naší studie získat detailní informace o funkci mitochondrií lidského kosterního svalu v protrahované fázi kritického onemocnění. Dále jsme studovali vliv složení experimentálního prostředí (mastné kyseliny, glutamin) na mitochondriální bioenergetiku. MATERIÁL a METODY: Získali jsme vzorky kosterního svalu kriticky nemocných a kontrolní skupiny pacientů (biopsie m. vastus lateralis). Na homogenátu lidského kosterního svalu jsme pomocí vysokoúčinné respirometrie analyzovali mitochondriální respirační aktivitu, spektrofotometricky jsme měřili individuální funkční kapacitu jednotlivých komplexů dýchacího řetězce a technikou western blot jsme stanovovali koncentrace jednotlivých podjednotek dýchacího řetězce. Na kulturách lidských myoblastů a myotub jsme analyzovali mitochondriální respirační parametry pomocí extracelulárního fluxu a studovali jsme vliv složení extracelulárního prostředí na bioenergetiku. VÝSLEDKY: Aerobní produkce ATP je...
|
|
|
Genetic and functional characterisation of mitochondrial diseases caused by ATP synthase defects
Tauchmannová, Kateřina ; Houštěk, Josef (vedoucí práce) ; Flachs, Pavel (oponent) ; Kutejová, Eva (oponent)
Poruchy ATP syntázy, klíčového enzymu mitochondriální tvorby energie, patří mezi velmi časté příčiny metabolických onemocnění, které se projevují nejčastěji jako mitochondriální encefalo-kardio-myopatie s časným nástupem nemoci. U pacientů s izolovaným defektem ATP syntázy byly nalezeny mutace ve čtyřech jaderných genech, se shodným biochemickým projevem - výrazně sníženým množstvím plně asemblovaného a funkčního komplexu ATP syntázy. V této práci jsou shrnuty výsledky studií proteinu TMEM70, nového pomocného faktoru v biogenezi ATP syntázy, jenž představuje nejčastější genetickou příčinu závažných vrozených poruch ATP syntázy. TMEM70 o velikosti 21 kDa je proteinem vnitřní mitochondriální membrány, který napomáhá tvorbě ATP syntázového komplexu. Funkce proteinu TMEM70 je nejspíše zprostředkována pomocí C-konce, exponovaného do mitochondriální matrix, ale přesný mechanismus stále není znám. Ve fibroblastech pacientů, které neobsahují protein TMEM70, je nízká aktivita ATP syntázy kompenzována zvýšením obsahu komplexů dýchacího řetězce III a IV pomocí posttranslačního mechanizmu. Dalším typem defektu ATP syntázy, který byl v rámci této práce studován, je mtDNA mutace m.9205delTA, která ovlivňuje maturaci MT-ATP8/MT-ATP6/MT-CO3 mRNA a tím i biosyntézu strukturních podjednotek Atp6 (podjednotka a) a...
|
|
|
Regulation and Disorders of Mammalian Cytochrome c Oxidase
Kovářová, Nikola ; Houštěk, Josef (vedoucí práce) ; Stibůrek, Lukáš (oponent) ; Kalous, Martin (oponent)
Cytochrom c oxidáza (COX) je koncovým enzymovým komplexem dýchacího řetězce a vyskytuje se ve vnitřní mitochondriální membráně jako monomer, dimer a ve formě respiračních superkomplexů. Asemblační proces COX je komplikovaný, vysoce regulovaný a závisí na mnoha pomocných proteinech. Mutace COX podjednotek, kódovaných mitochondriální nebo jadernou DNA, nebo mutace v genech pro COX asemblační proteiny jsou častopu příčinou závažných mitochondriálních onemocnění. SURF1 protein je zapojen do počátečních fází tvorby COX, ale jeho přesná funkce není objasněna. Mutace lidského SURF1 genu vedou k těžkému defektu COX a fatálnímu neurodegenerativnímu onemocnění, Leigh syndromu. Knockout SURF1 genu u myši způsobuje také izolovaný COX defekt, ale méně výrazný a bez postižení CNS. Cílem práce byla detailní analýza narušené COX biogeneze vyvolané mutací nebo knockoutem SURF1 genu, od tvorby COX monomeru a vestavění COX do superkomplexů až po ovlivnění ostatních OXPHOS komplexů izolovaným defektem COX. Mutace SURF1 genu ve fibroblastech pacientů vedly k výrazné akumulaci asemblačního intermediátu COX a defektu tvorby funkčního COX monomeru, který se preferenčně vázal do I-III2-IV1 superkomplexu. COX deficience následně vedla ke zvýšení obsahu OXPHOS komplexů I, III a V. U SURF1-/- myší byl COX defekt výrazně...
|
|
|
Structural and Functional Interactions of Mitochondrial ADP-Phosphorylating Apparatus
Nůsková, Hana ; Houštěk, Josef (vedoucí práce) ; Kolarov, Jordan (oponent) ; Kuda, Ondřej (oponent) ; Panicucci Zíková, Alena (oponent)
Komplexy oxidativní fosforylace (OXPHOS) se ve vnitřní mitochondriální membráně sdružují ve vyšší strukturní a funkční celky, tzv. superkomplexy. Jejich význam spočívá v cíleném směrování substrátu z jednoho komplexu na druhý. V případě ATP syntázy byly popsány její dimery i vyšší oligomery a také ATP syntazom, v rámci nějž dochází k seskupení ATP syntázy s přenašečem adeninových nukleotidů (ANT), zajišťujícím výměnu syntetizovaného ATP za cytosolické ADP, a fosfátovým přenašečem (PiC), umožňujícím import fosfátu do matrix mitochondrie. I když je existence tohoto superkomplexu obecně přijímána, experimentální důkazy nejsou dostatečné. V rámci této práce byly detailně zkoumány strukturní interakce ATP syntázy, ANT a PiC. Jejich vzájemné vztahy byly sledovány nejprve na úrovni exprese jednotlivých komponent ATP syntazomu, ať již za fyziologických podmínek v různých tkáních potkana, nebo na modelu deficiencí ATP syntázy v buňkách pacientů s různými genetickými defekty ATP syntázy. Konkrétně se jednalo o mutace v jaderných genech ATP5E a TMEM70, které kódují podjednotku ε, respektive pomocný faktor v biogenezi ATP syntázy TMEM70, a o mikrodeleci na rozhraní genů MT-ATP6 a MT-COX3, která negativně ovlivňuje mitochondriální translaci podjednotek a ATP syntázy a Cox3 cytochrom c oxidázy. Funkční a...
|
|
|
Mitochondrial ATP synthase deficiencies of a nuclear genetic origin
Karbanová, Vendula ; Houštěk, Josef (vedoucí práce) ; Kalous, Martin (oponent) ; Rossmeisl, Martin (oponent)
ATP syntáza je klíčový enzym buněčného metabolismu a defekty ATP syntázy patří k nejzávažnějším mitochondriálním onemocněním postihujícím dětskou populaci. Cílem této práce bylo identifikovat genetické defekty a popsat patogenní mechanismy narušení biosyntézy ATP syntázy, které vedou k izolované deficienci tohoto enzymu a projevují se jako mitochondriální encefalomyopatie s nástupem v novorozeneckém věku. Studie skupiny 25 pacientů vedla k identifikaci dvou jaderných genů zodpovědných za deficienci ATP syntázy. První postižený gen byl TMEM70 kódující neznámý mitochondriální protein. Tento protein byl popsán jako nový asemblační faktor ATP syntázy, první specifický pro vyšší eukaryota. Jeho velikost je 21 kDa, nachází se ve vnitřní mitochondriální membráně a není přítomný v tkáních pacientů. Mutace v TMEM70 genu byla nalezena u 23 pacientů a ukázala se být nejčastější příčinou deficience ATP syntázy. Studie na buněčných kulturách ukázaly, že defekt enzymu vede ke kompenzačně-adaptačnímu zvýšení komplexů IV a III respiračního řetězce způsobenému posttranskripční regulací jejich biosyntézy. Druhým postiženým genem byl ATP5E, který kóduje malou strukturní epsilon podjednotku ATP syntázy. Záměna konzervovaného Tyr12 za Cys způsobuje významný pokles obsahu ATP syntázy, ale zároveň akumulaci hydrofobní...
|
|
|
Zastoupení komponent ATP synthasomu v různých tkáních potkana a u pacientů s defektem ATP synthasy
Mikulová, Tereza ; Houštěk, Josef (vedoucí práce) ; Kalous, Martin (oponent)
Komplexy oxidační fosforylace (OXPHOS) vytváří v rámci vnitřní mitochondriální membrány vyšší strukturní a funkční celky, tzv. superkomplexy, které umožňují cílené směrování substrátu z jednoho komplexu na druhý. I ATP synthasa je schopna organizovat se do komplexnějších struktur. V savčích mitochondriích se běžně vyskytuje v dimerní podobě, existují důkazy o její trimerizaci a dokonce i tetramerním uspořádání. Ukazuje se, že dochází i k vzájemnému propojení komponent mitochondriálního fosforylačního aparátu tvořeného ATP synthasou katalyzující fosforylaci ADP na ATP, přenašečem adeninových nukleotidů (ANT) zabezpečujícím výměnu nasyntetizovaného ATP za ADP přes vnitřní mitochondriální membránu a fosfátovým translokátorem (PiC), který umožňuje import anorganického fosfátu (Pi) do matrix mitochondrie. Tyto komponenty by mohly vytvářet superkomplex, tzv. ATP synthasom, který by zvyšoval efektivitu jednotlivých procesů vedoucích k tvorbě ATP. V této práci byly nejprve sledovány obsahy složek fosforylačního aparátu v souvislosti s rozdílným obsahem ATP synthasy v mitochondriích izolovaných celkem z devíti tkání potkana. Proteiny z izolovaných mitochondrií byly separovány pomocí elektroforéz za denaturujících podmínek (SDS-PAGE) a jejich množství byla analyzována specifickými protilátkami. Podle...
|
|
|
Study of metabolic syndrome in mice model: roles of dietary lipids, adipose tissue and AMP-activated protein kinase
Medříková, Daša ; Kopecký, Jan (vedoucí práce) ; Houštěk, Josef (oponent) ; Novotný, Jiří (oponent)
SOUHRN Obezita a přidružené metabolické poruchy jsou velkým problémem moderní společnosti. Příčinami celosvětového nárůstu obezity jsou sedavý životní styl, vyšší kalorický příjem a v neposlední řadě změna ve složení potravy. Jednou z příčin vysoké prevalence obezity v současné populaci může být posun poměru mezi obsahem n-6 a n-3 mastných kyselin (MK) v dietě směrem k vyššímu obsahu n-6 MK. Na rozdíl od n-6 MK, se n-3 MK vyznačují antiatherogenními, antiobezogenními a protizánětlivymi účinky. Podařilo se nám prokázat pozitivní schopnosti přírodních i chemicky modifikovaných n-3 vícenenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem v prevenci i reverzi metabolického syndromu u zvířecího modelu, u myší vystavených působení diety s vysokým obsahem tuku. Další studium bylo zaměřeno na průkaz významu jednoho z hlavnich regulačních mechanizmů lipidového metabolizmu, enzymu AMP-aktivované proteinové kinázy (AMPK), pro indukci netřesové tvorby tepla ve svalu vlivem vysokotukové diety. Zjistili jsme, že zvýšení krevních hladin leptinu v důsledku vysokého příjmu tuků vyvolá aktivaci AMPK ve svalu. To vede k indukci katabolizmu lipidů a částeční ochraně organizmu před obezitou. Kromě leptinu působí jako aktivátory AMPK také vícenenasycené MK, i když ty jsou do procesu aktivace zapojené nepřímo, přes zvýšení krevních...
|
|
| |
host ::
RSS.