|
| |
|
|
Studium transportních proteinů z rodiny Nramp
Surá, Lucie ; Chaloupka, Roman (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent)
The Natural Resistance-Associated Macrophage Proteins (Nramp) form functionally conserved family of proton-dependent divalent metal ion transporters. In the present study, we investigated transport properties of a prokaryotic Nramp homolog - MntH transporter from Escherichia coli. H+ transport mediated by MntH was monitored in a bacterial model system using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin). Our experimental conditions enabled us to observe an uncoupled H+ transport mediated by MntH. Uncoupled H+ flux had been previously described in eukaryotic Nramp proteins, nevertheless this is the first observation of this phenomenon in a prokaryotic homolog. We demonstrated that the uncoupled H+ transport is pH- and temperature- dependent. The uncoupled transport H+ is also affected by specific single-point mutations at functionally important residues Asp34, His211 and Asn401. The second part of the work focused on effect of different ions, which are not MntH substrates, on transport properties of MntH. It was shown that addition of excess calcium or magnesium resulted in increase of H+ transport induced by divalent metal ions, but on the other hand our data suggest that calcium inhibits uncoupled H+ transport.
|
|
| |
|
| |
|
|
Studium farmakologie a funkce vazebných míst nikotinových acetylcholinových receptorů
Kaniaková, Martina ; Krůšek, Jan (vedoucí práce) ; Chaloupka, Roman (oponent) ; Zemková, Hana (oponent)
Název práce: Studium farmakologie a funkce vazebných míst nikotinových acetylcholinových receptorů Autor: Mgr. Martina Kaniaková Katedra / Ústav: Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Vedoucí disertační práce: RNDr. Jan Krůšek, CSc., Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Abstrakt: Nikotinové acetylcholinové receptory (nAChR) jsou ligandem otevírané iontové kanály. Jejich funkční vlastnosti a možnosti farmakologického ovlivnění jsme studovali prostřednictvím techniky terčíkového zámku (patch-clamp) v konfiguraci měření proudu z celé buňky. Zkoumali jsme vlastnosti neuronálních receptorů heterologně exprimovaných v linii COS buněk a svalových receptorů přirozeně exprimovaných buněčnou linií TE671. Lobelin, rostlinný alkaloid s dlouholetou historií terapeutického využití, je schopen přímé interakce s nikotinovými acetylcholinovými receptory ve vazebném místě pro agonistu. Zjistili jsme, že výsledný účinek této interakce je závislý na aplikované koncentraci lobelinu, přítomnosti dalšího agonisty, časovém schématu aplikace a v neposlední řadě na podtypu receptoru. Souhrnně lze lobelin označit za velmi slabého parciálního agonistu nAChR s výraznou schopností desensitizovat některé podtypy receptorů. V kombinaci s jinými agonisty lobelin účinkuje buď jako kompetitivní antagonista nebo koagonista. Pomocí bodových mutací jsme...
|
|
|
Stechiometrie transportu membránovým transportním proteinem MntH bakterie E. coli
Doležalová, Iva ; Chaloupka, Roman (vedoucí práce) ; Marešová, Lydie (oponent)
Rodina Nramp(Natural Resistance-Associated Macrophage Protein) zahrnuje proteiny, které zprostředkovávají symport dvojmocných kovových iontů spolu s protony do buňky. Kovové ionty mají v buněčném organismu velký význam, podílejí se na celé řadě důležitých vnitrobuněčných procesů. Proto jsme se studiem stechiometrie transportu bakteriálním proteinem MntH (Proton-dependent Manganese Transporter) z této rodiny snažili rozšířit naše znalosti o funkci a charakteristikách celé této rodiny. Zkoumáním divokého typu proteinu MntH a proteinu s mutací N401G, u které byly již dříve pozorovány funkční odchylky, jsme zjistili výrazný vliv vnějšího pH na stechiometrii transportu. Funkční rozdíly mezi divokým typem a proteinem s mutací N401G se projevily pouze v kyselejším vnějším pH. V experimentálních podmínkách, při nichž byl již dříve pozorován odpřažený tok protonů proteinem MntH, jsme zjistili, že vápník způsobuje nejen inhibici odpřaženého toku protonů tímto proteinem, ale i aktivaci spřaženého toku protonů. To může mít spojitost s tím, že se vápenaté ionty tímto proteinem také přenáší. Překvapivě však přidání vápenatých iontů ani změna vnějšího média nemají signifikantní vliv na hodnotu stechiometrie transportu divokým typem MntH ani proteinem s mutací N401G.
|
|
| |
|
|
Biophysical studies of membrane transport proteins from Nramp/MntH family and their function
Ňuňuková, Věra ; Chaloupka, Roman (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Kubala, Martin (oponent)
Syntetické peptidy odpovídající svojí sekvencí transmembránovým segmentům TMS1, TMS3 a TMS6 sekundárně aktivního transportního proteinu MntH z bakterie Escherichia coli byly použity jako model pro studium struktury, interakce s modelovými membránami, vzájemné interakce TM segmentů a jejich funkce. Sekundární struktura byla pomocí spektroskopie cirkulárního dichroismu určována v různých prostředích. Studované peptidy interagovaly s lipidovou membránou a získávaly v tomto prostředí helikální konformaci. Elektrofyziologické experimenty dokázaly, že samostatné TMS jsou schopny za určitých podmínek tvořit iontové kanály v modelových biologických membránách. Elektrofyziologické vlastnosti těchto slabě kationtově selektivních kanálů jsou silně závislé na pH okolního prostředí. Mangan, jako fyziologický substrát MntH, zvýšil vodivost kanálů tvořených TMS1 a TMS6 a ovlivnil přechod mezi zavřeným a otevřeným stavem kanálu. Byl pozorován vliv manganu na konformaci všech studovaných peptidů. V případě TMS3 byla přítomnost Mn2+ pro tvorbu iontových kanálů dokonce nezbytná. Bylo dokázáno, že kanál tvořený funkčně důležitým TMS může do určité míry zachovat funkční vlastnosti celého proteinu. Tyto výsledky mohou přispět k porozumění vztahu mezi strukturou a funkcí na molekulární úrovni. I přesto však zůstává nejasné, do...
|
|
|
Regulace vnitřního pH kvasinek - vliv vybraných transportních proteinů
Zalom, Peter ; Chaloupka, Roman (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Intracelulární pH ovlivňuje téměř všechny biochemické procesy v kvasinkách. Regulace cytosolického pH zahrnuje funkci mnoha transportních proteinů. Vliv vybraných sodných transportérů na cytosolcké pH byl zkoumán u dvou druhů kvasinek: Saccharomyces cerevisiae a Zygosaccharomyces rouxii včetně divokých kmenů a mutantů s ovlyvněným transportem sodíku. Měření cytosolického pH a pufrační kapacity bylo provedeno za použití fluorescenční sondy pHluorin - pH citlivého derivátu zeleného fluorescenčního proteínu. Bylo porovnáno několik postupů pro kalibraci fluorescenční odezvy pHluorinu na cytozolické pH. Byla prokázána důležitost korekce pro získaní správnych kalibračních křivkek . Bylo zjisteno, že cytosolické pH je ovlivněno transportním proteinem Nha1 jak v S. cerevisiae tak i v Z. Rouxii, ale ne transportérem Sod2-22 přítomným v Z. rouxii. Bylo prokázáno, že pufrační kapacita cytosolu klesá v přítomnosti glukózy ve všech studovaných kmenech.
|
|
| |
host ::
RSS.