|
|
Study on PHa biosynthesis by cyanobacteria
Drinka, Jakub ; Kouřilová, Xenie (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
This bachelor thesis concerns with the effect of selected environmental stresses towards the viability of cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechocystis salina CCALA 192. Both strains were studied via flow cytometry using the appropriate fluorochromes while also observing the applicability of these stains and precision of this method in the analysis of cyanobacterial cultures. In spite of the optimization being carried out, fluorescein diacetate was not suitable for the analysis of these cells because of their autofluorescence interfere with the fluorochrome emissions. Therefore, SYTOXTM Blue Dead Cell stain was used for the further experiments. A cryoprotective effect of polyhydroxybutyrate was observed during the freezing-thawing cycles. On the other hand, the culture rich in PHB seemed to be less resistant towards the oxidative stress induced by the hydrogen peroxide, probably justifiable by the state of chlorosis. Furthermore, this thesis deals with the increase/decrease in biomass concentration and intracellular PHB pool as a response to the external carbon source addition, analysed by the gas chromatography paired with FID detection. The most intesive cell growth in Synechocystis sp. PCC 6803 was detected in the presence of sodium acetate combined with gamma-butyrolactone while the highest PHB content in the medium supplied with acetate and 1,4-butanediol. Nevertheless, Synechocystis salina CCALA 192 showed markedly higher polyhydroxybutyrate accumulation under both photoautotrophic and mixotrophic conditions, the only non-suitable substrate was gamma-butyrolactone.
|
|
|
Adaptation to adverse osmotic conditions as a tool for evolutionary enginnering of bacteria
Drotárová, Lenka ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
This bachelor thesis deals with the application of osmotic stress as a tool for evolutionary engineering of PHA producing bacterial strains. The aim of this thesis is to evaluate a bacterial adaptation to hypoosmotic environment, as an engineering tool in order to increase the production of PHA. The theoretical part focuses on the evolutionary engineering principle, methods of the strategy and the effect of physical factors on microorganism. The aim of experimental part was to performed an adaptive evolutionary experiment with the bacterial strain Halomonas halophila CCM 3662. Reduced osmotic pressure was used as a stressing factor during the serial cultivation. In order to generate PHA producing mutant strains, each passage was characterized using spectrophotometric and gravimetric method and by GC-FID. It was found that after the long-term cultivation, the mutant strain HH35, cultivated in 35 g/l NaCl, was associated with the highest biomass and PHB concentration. The 15th and 30th passages, along with the wild type strain H. halophila were subjected to further cell-robustness analysis with the application of hyper- and hypoosmotic shock. The stress response, viability of cells and morphological changes were analyzed using FC and TGA methods. Isolated polymers were characterized using FTIR analysis.
|
|
|
Charakterizace vybraných bakteriálních kmenů získaných během evolučních experimentů
Hrabalová, Vendula ; Sedláček, Petr (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce se zabývá použitím evolučního inženýrství na bakteriální kmeny produkující polyhydroxyalkanoáty (PHA). Cílem této práce byla charakterizace adaptovaných bakteriálních kmenů na vybrané selekční tlaky. Pro evoluční experimenty byly vybrány dvě bakterie, Cupriavidus necator H16 a Halomonas halophila. Selekční tlaky, kterými se působilo na bakterie byly měďnaté kationty (Cu2+) a chlorid sodný (NaCl) pro C. necator H16, a kyselina octová (AA) a levulová (LA) pro H. halophila. Adaptované kmeny byly v průběhu dlouhodobých evolučních experimentů charakterizovány co do obsahu PHA a jeho Mw pomocí analýz GC-FID a SEC-MALS. Dále byl studován růst jednotlivých adaptovaných kmenů měřením optické hustoty. Pomocí spektrálního FC byla následně změřena procenta živých buněk po vystavení bakterií vybraným stresovým faktorům. Byly stanoveny specifické enzymové aktivity vybraných enzymů citrátového a glyoxalátového cyklu, enzymů generujících NADPH, enzymu zapojeného do metabolismu LA a enzymů biosyntézy PHA. U všech experimentů byly adaptované kmeny porovnávány s kmeny divokými. Optimální adaptace se projevila u bakterie C. necator H16 na Cu2+. Bakterie H. halophila byla na závěr kultivována v hydrolyzátu z lignocelulózových odpadů, kdy bylo zjištěno, že adaptovaný kmen H. halophila na LA je schopen produkovat více PHA než kmen původní.
|
|
|
Molekulárně biologická charakterizace vybraných producentů PHA
Kubáčková, Eliška ; Brázda, Václav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá molekulárně biologickou charakterizací vybraných producentů polyhydroxyalkanoátů (PHA). V rámci práce byly pomocí molekulárně biologických metod identifikovány a charakterizovány PHA produkující termofilní izoláty pocházející ze vzorků aktivovaného kalu a kompostu. Sekvenací 16S rRNA genu byly termofilní izoláty identifikovány a taxonomicky zařazeny do kmene bakterií Firmicutes. U těchto bakteriálních izolátů byla stanovena schopnost produkce PHA na úrovni genotypu pomocí konvenční PCR detekcí phaC genu kódujícího PHA syntázu, který je klíčovým enzymem biosyntézy PHA. U většiny izolovaných bakterií byly detekovány PHA syntázy I., II. a IV. třídy, přičemž PHA syntázy tříd I a II nejsou pro detekované rody bakterií charakteristické. Největšího zastoupení izolátů představoval druh termofilní bakterie Aneurinibacillus thermoaerophilus, u kterého byla detekována PHA syntáza IV. třídy. V druhé části diplomové práce byla zavedena metoda RT-qPCR pro studium exprese vybraných genů bakterie Cupriavidus necator H16 zapojených do metabolismu PHA. V rámci zavedení metody byla provedena optimalizace PCR detekce vybraných genů a optimalizována kvantifikace genů pomocí real-time PCR. Testovaná metoda zahrnovala kroky izolace RNA, syntézu cDNA a kvantifikaci úseků genů, u nichž byly na základě získaných dat stanoveny kritické body metody.
|
|
|
Stresová odolnost PHA akumulujících bakterií vůči podmínkám v gastrointestinálním traktu
Kovářová, Radka ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá stresovou odolností bakterií produkující PHA vůči nepříznivým podmínkám v gastrointestinálním traktu. Za tímto účelem byly zvoleny dva bakteriální kmeny jako modelové mikroorganismy. Cupriavidus necator H16 produkující PHA a její mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4 bez schopnosti akumulace PHA. Pro experimentální část byly nejprve vybrány tři šťávy o různých koncentracích, konkrétně žaludeční, žlučová a pankreatická. Dále byla stanovována viabilita stresovaného bakteriálního kmene pomocí plotnové metody a průtokového cytometru. Mezi další využité metody patří antimikrobiální testy. První z těchto testů byla použita agarová difúzní metoda, díky které byly stanoveny a porovnány velikosti inhibičních zón. Poslední metoda, která byla provedena, je bujónová diluční metoda, sloužící k porovnání absorbancí čistých bakteriálních suspenzí a stresovaných suspenzích s danou šťávou o určité koncentraci. Z výsledků je patrné, že produkce PHA představuje v kontextu expozice stresovým podmínkám gastrointestinálního traktu především nevýhodu pro akumulující bakteriální kmen.
|
|
|
Study on PHA production by selected thermophillic bacteria
Brondová, Zuzana ; Müllerová, Lucie (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
This bachelor thesis deals with the study of thermophilic bacterial strains Tepidiphilus thermophilus and Chelatococcus daeguensis aimed at the production of polyhydroxyalkanoates (PHA). Experiments were developed to determine properties of use of these microorganisms in the biotechnological industry. In the experimental parts, the presence of the phaC gene indicating PHA production was confirmed by both bacteriological strains by polymerase chain reaction (PCR). Subsequently, the conditions for PHA production were optimized. Condition profiling aimed at determining the optimal temperature, optimal carbon source, and the effect of the precursor on cell growth, composition and amount of PHA through GC-FID. The last experiment was to determine the utilization of selected substrates. The optimal conditions for the Tepidiphilus thermophilus strain were temperature above 55 ° C and glycerol as the best carbon source. Precursors inhibited cell growth, but the highest amount of 3HV was determined when valeric acid was added to medium. The Chelatococcus daeguensis strain had an optimal temperature of 45 ° C and glucose was optimal carbon source. The best cell metabolizing precursor was 1,4-butanediol. Both bacterial strains were capable of utilizing many substrates where glucose and valeric acid were best.
|
|
|
Vliv schopnosti akumulace PHA na odolnost bakterií vůči bakteriocidním léčivům
Hrabalová, Vendula ; Kučera, Dan (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá vlivem bakteriocidních léčiv na bakterii kmene C. necator H16 a jejímu mutantnímu kmenu PHB-4. Kmen H16 je schopen akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA) ve formě granulí, zatímco kmen PHB-4 tuto schopnost postrádá. Teoretická část bakalářské práce se zaměřuje na vliv antibiotik na bakterie obecně a možností stanovení citlivosti mikroorganismů vůči antimikrobiálním látkám. V experimentální části byl testován vliv tří vybraných antibiotik (nisin, streptomycin a penicilin) na oba kmeny. Stanovena byla viabilita bakterií pomocí plotnové metody a průtokového cytometru. Dále byly použity antimikrobiální testy, konkrétně agarová difúzní metoda a bujónová diluční metoda. Ukázalo se, že produkce PHA snižuje odolnost buněk vůči antimikrobiálním látkám, protože kmen C. necator H16 je citlivější vůči působení streptomycinu a penicilinu než kmen C. necator PHB-4.
|
|
|
Evoluční inženýrství bakterií produkujících polyhydroxyalkanoáty
Nováčková, Ivana ; Kovalčík, Adriána (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá aplikací evolučního inženýrství na PHA produkující kmeny. Cílem práce je připravit prostřednictvím metod evolučního inženýrství kmeny adaptované na kyselinu levulovou, jakožto vybraný stresový faktor, a následně tyto kmeny charakterizovat. Teoretická část práce se zabývá především evolučním inženýrstvím a polyhydroxyalkanoáty. Pro evoluční experimenty byl využit bakteriální kmen Cupriavidus necator H16. Za účelem přípravy adaptovaných kmenů byla aplikována jednak samotná kyselina levulová, jednak kyselina levulová v přítomnosti mutagenu MMS. Selekce vhodných mutantů byla posuzována na základě růstového potenciálu a obsahu PHA v biomase. U pěti získaných PHA produkujících adaptovaných mutantů a kontroly byly prostřednictvím metod GC-FID, SEC-MALS, DSC a FT-IR charakterizovány vyizolované polymery. Bylo zjištěno, že vyšší obsah 3HV v kopolymeru vedl k nižší krystalinitě a tím i k nižší teplotě tání, z trendu se vymykal pouze kopolymer kmene M0151. Kromě charakteristik polymerů byly z biochemického hlediska posuzovány i samotné kmeny, a to prostřednictvím stanovování aktivit vybraných enzymů citrátového, glyoxalátového a 2-methylcitrátového cyklu, vybraných enzymů generujících NADPH, enzymu katabolismu kyseliny levulové a enzymů biosyntézy PHA. Na základě získaných dat byly diskutovány možné adaptační strategie, kdy se nejvíce odlišovat kmen E0575. Hodnoty specifických enzymových aktivit byly podrobeny metodám statistické analýzy AHC a PCA.
|
|
|
Využití PHA produkujících kmenů v bioremediačních technologiích
Šuráňová, Zuzana ; Sedláček, Petr (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem diplomové práce bylo studium využití PHA produkujících kmenů v bioremediačních technologiích. Pro tuto studii byly vybrány bakterie Pseudomonas putida KT2440 a dva izoláty z půdy zamořené ropou - Pseudomonas gessardii (D2) a Pseudomonas fulva (D3). V experimentální části byla studována především biodegradace odpadního peří pomocí testovaných mikrobiálních kmenů. Všechny testované bakterie vykazovaly biodegradační aktivitu vůči peří a byly jej schopny utilizovat jako jediný zdroj uhlíku. V průběhu biodegradačního procesu byl monitorován hmotnostní úbytek peří, aktivita proteáz a keratináz, koncentrace bakteriální biomasy, obsah PHA a také pH. Ukázalo se, že nejvyšších keratinázových aktivit i stupně degradace peří bylo dosaženo u bakterie Pseudomonas putida. Při kultivaci na odpadním peří žádná z testovaných bakterií neakumulovala detekovatelné množství PHA, nicméně biomasu nakultivovanou při biodegradaci peří je možné využít jako inokulum pro biotechnologickou výrobu MCL-PHA na odpadním oleji a kyselině oktanové. U bakterie Pseudomonas putida bylo v tomto experimentálním schématu dosaženo vysokého obsahu MCL-PHA v biomase - téměř 54% suché hmoty biomasy. V další části práce byla studována biodegradace nafty, ze studovaných bakteriálních kmenů bylo nejvyššího růstu biomasy, a tedy i biodegradačního potenciálu dosaženo u bakterie Pseudomonas fulva.
|
|
|
Souvislost mezi schopností bakterií odolávat teplotnímu stresu a akumulovat PHA
Nováčková, Ivana ; Benešová, Pavla (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá zapojením polyhydroxyalkanoátů (PHA) do stresové odpovědi bakterií, a to konkrétně při působení teplotního stresu. Teoretická část práce se zaměřuje na stresovou odpověď bakterií obecně, na mechanismus odpovědi vůči teplotnímu stresu a na zapojení PHA do stresové odpovědi. V rámci experimentální práce byla zkoumána souvislost mezi množstvím PHA v biomase bakterií a jejich viabilitě po působení teplotního stresu. Pro práci byly využity PHA produkující kmeny Cupriavidus necator H16, Burkholderia cepacia a Burkholderia sacchari a PHA neprodukující mutantní kmen Cupriavidus necator PHB4. Bakterie akumulovaly poly(3-hydroxybutyrát) (PHB), přičemž jeho množství v biomase bylo stanovováno pomocí plynové chromatografie s FID. Viabilita živých bakteriálních buněk i buněk po expozici teplotním stresům byla stanovována pomocí průtokové cytometrie. Ukázalo se, že obsah PHB v biomase napomáhal bakteriím odolávat mrazovému šoku. Na základě porovnání viability bakterií C. necator H16 a C. necator PHB4 po expozici kombinovaným stresům bylo rovněž pozorováno, že PHB zvyšoval odolnost buněk vůči teplotnímu stresu a stresu způsobenému nízkým pH.
|
host ::
RSS.