|
|
Separace a stanovení možných produktů enzymového štěpení 4-nitrofenyl-N,N'-diacetyl-β-D-chitobiosidu pomocí kapilární elektroforézy
Velvarská, Romana ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kalíková, Květa (oponent)
Tato práce se zabývá vývojem a optimalizací podmínek metody, kterou lze využít k porovnání aktivity enzymu β-N-acetylhexosaminidasy při hydrolýze jejího přirozeného substrátu a tvz. chromogenního substrátu, který se často využívá při studiu enzymové kinetiky. Jako substrát pro štěpení byl zvolen 4-nitrofenyl-N,N'-diacetyl-β- D-chitobiosid. Tento oligosacharid obsahuje vazbu, kterou enzym štěpí v přirozeném substrátu, a zároveň také vazbu, která se vyskytuje v substrátu chromogenním. Pro stanovení produktů, jež vznikají při enzymatické hydrolýze 4-nitrofenyl-N,N'-diacetyl- β-D-chitobiosidu byla využita kapilární zónová elektroforéza. Nejprve bylo nutno najít optimální složení základního elektrolytu, tedy jeho hodnotu pH a koncentraci. Optimálním základním elektrolytem byl roztok tetraboritanu sodného o koncentraci 25 mmol/l a hodnotě pH 10,25. Následně byla zjištěna opakovatelnost měření, kalibrační závislosti a linearita, limit detekce a limit kvantifikace. Opakovatelnost migračních časů se pohybovala do 0,6%, opakovatelnost plochy píků pak v rozmezí 2,5 až 6,3%. Limity detekce metody byly v rozmezí 0,005-0,120 mmol/l. Nakonec byla optimalizovaná metoda úspěšně použita ke sledování průběhu skutečného enzymového štěpení.
|
|
|
Využití kapilární elektroforézy v rámci forenzních molekulárně genetických zkoumání
Grafnetterová, Anna ; Doubková, Klára (vedoucí práce) ; Coufalová, Pavla (oponent)
4 Abstrakt Kapilární elektroforéza (CE) je metoda založená na principech tradiční deskové elektroforézy. Díky moderním způsobům fluorescenčního značení a jeho detekce, dosahuje vyšší spolehlivosti analýzy a přesnějších výsledků. Tato metoda je využitelná v mnoha oborech, kde dokonce může nahradit doposud používané metody jako je např. vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). Důležité využití CE je ve forenzním zkoumání, kde se jedná především o identifikaci jedince na základě analýzy DNA i z velmi malého množství materiálu. Tím se zabývá tzv. STR analýza, která pro své účely využívá krátké tandemové repetice (STR) vykazující vysokou variabilitu v populaci. K získání správných dat je důležité odpovídající vybavení, přístroje, softwary, kity, na jejichž vývoji se podílejí i komerční firmy jako je Promega Corporation a Applied Biosystems. Celá analýza vede k získání DNA profilu a jeho vyhodnocení na základě shody vzorků získaných na místě činu a kontrolních (srovnávacích) vzorků. STR analýzu lze využít kromě lidské DNA i u zvířecí DNA zejména v chovu koní, skotu apod., kde napomáhá určení původu jedince a výběru jedince s nejlepšími znaky. Klíčová slova: kapilární elektroforéza fluorescenční značení STR STR analýza DNA profil
|
|
|
Vývoj metody kapilární elektroforézy pro stanovení fosforylovaných složek bakteriálních buněčných membrán
Červinková, Jana ; Čabala, Radomír (vedoucí práce) ; Coufal, Pavel (oponent)
Název práce: Vývoj metody kapilární elektroforézy pro stanovení fosforylovaných složek bakteriálních buněčných membrán Autor: Jana Červinková Katedra (ústav): Katedra analytické chemie Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Radomír Čabala, Dr. Abstrakt: Obsahem práce je provedení úvodní literární rešerše o metodách analýzy a stanovení fosforylovaných látek přítomných v cytoplazmatické membráně bakterií. Jedná se především o majoritní fosfatidylglycerol, kardiolipin a fosfatidylethanolamin a minoritní fosfatidylserin, kyselinu fosfatidovou a lysylfosfatidylglycerol. Tyto látky jsou spolu s mastnými kyselinami hlavní stavební součástí buněčných membrán a lze je do určité míry používat buď na identifikaci druhů bakterií, nebo na studium chování bakterií za různých podmínek. Pro jejich stanovení bude vyvinuta analytická metoda založená na částečně či zcela nevodné kapilární elektroforéze se spektrofotometrickou detekcí. V rámci bakalářské práce by měly být nalezeny optimální experimentální podmínky separace standardů vybraných látek. Klíčová slova: fosforylované látky, bakteriální cytoplazmatická membrána, kapilární elektroforéza, tenkovrstvá chromatografie, Bacillus subtilis.
|
|
|
Elektroforéza v krátkých kapilárách
Podhorná, Petra ; Opekar, František (vedoucí práce) ; Samcová, Eva (oponent)
V laboratoři sestrojená aparatura byla použita k elektroforetické separaci v krátké kapiláře. K ověření základních funkcí aparatury byl použit vzorek K+ a Na+ iontu. Z naměřených elektroferogramů byly vypočítany základní parametry (separační účinnost, rozlišení, migrační čas). Dále byla na aparatuře separována a detegována uměle připravená směs bazických aminokyselin (arginin, lysin, histidin a jeho deriváty 3-metylhistidin a 1-metylhistidin). Poslední fází bylo stanovení histidinu v reálném vzorku - moči. Klíčová slova: kapilární elektroforéza, krátká kapilára, bazické aminokyseliny
|
|
|
Studium β-N-acetylhexosaminidasy v rostlinách tabáku
Valenta, Robert ; Tichá, Marie (oponent) ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce)
β-N-acetylhexosaminidasy jsou přítomny ve všech živých organismech, avšak informací o tomto enzymu v rostlinách a především listech je známo málo. V případě rostlinných β-N-acetylhexosaminidas se spekuluje o možné obranné funkci proti houbovým i jiným patogenům a také o degradaci zásobních glykoproteinů. Z listů tabáku (Nicotiana tabacum L.) byla precipitací síranem amonným, gelovou chromatografií na koloně Sephacrylu S-300 a afinitní chromatografií na koloně Con A-Sepharosy připravena β-N- acetylhexosaminidasa o specifické aktivitě 190 nmol min-1 mg-1 pro substrát p-NP-GlcNAc. Byla stanovena Michaelisova konstanta a maximální rychlost reakce β-N- acetylhexosaminidasy pro substrát p-NP-GlcNAc (Km = 0,33 mM a Vmax = 414 nmol min-1 mg-1 ). Pomocí kapilární elektroforézy bylo studováno štěpení diacetylchitobiosy β-N- acetylhexosaminidasou. Stanovená aktivita β-N-acetylhexosaminidasy pro diacetylchitobiosu byla více než jedenáctkrát nižší než v případě aktivity β-N-acetylhexosaminidasy pro substrát p-NP-GlcNAc. Z těchto výsledků lze usoudit, že chitobiosa, a pravděpodobně ani další chitooligomery, nejsou přirozeným substrátem β-N-acetylhexosaminidasy a tedy neslouží primárně k ochraně před houbovými patogeny. Přirozeným substrátem by mohly být spíše oligosacharidové řetězce glykoproteinů.
|
|
| |
|
|
Čipová a kapilární elektroforéza pro výzkum rakoviny
Hájková, Tereza ; Babula, Petr (oponent) ; Provazník, Ivo (vedoucí práce)
Práce se zabývá problematikou nádorového onemocnění a jeho vznikem. Karcinom prostaty je druhý nejzávažnější karcinom u mužů, je důležité zaměřit se na včasnou detekci. Tato práce pojednává o proteinech, které jsou nebo by mohly být využity jako potenciální nádorové markery. Například v současnosti běžně používaný prostatický specifický antigen, ale nově i metalothionein. Metalothionein je protein vyskytující se v rostlinné i v živočišné říši ve čtyřech základních isoformách. Existuje předpoklad, že obsah jednotlivých isoforem, případně jejich vzájemný poměr, má určitý diagnostický potenciál, který by mohl být využitelný v praxi. Z tohoto důvodu jsou vyvíjeny a studovány metody pro specifickou a citlivou analýzu jednotlivých isoforem. V této práci je pro separaci isoforem využita kapilární elektroforéza a jsou diskutovány vlivy jednotlivých parametrů (druh základního elektrolytu, jeho pH, velikost separačního napětí a tak dále) na výslednou separaci.
|
|
|
Vícerozměrné separace v kapalné fázi
Šesták, Jozef ; Čáslavský, Josef (oponent) ; Pulkrabová, Jana (oponent) ; Česla, Petr (oponent) ; Kahle, Vladislav (vedoucí práce)
Dizertační práce se zabývá problematikou vícerozměrných separací v kapalné fázi. Tyto separační techniky jsou vyvíjeny ve snaze splnit současné požadavky kladené na analýzu velmi složitých vzorků, jejichž komponenty jsou teplotně nestálé, mají nízkou tenzi par nebo vysokou molekulovou hmotnost a nelze je analyzovat s využitím dvourozměrné (2D) plynové chromatografie. V teoretické části práce jsou vysvětleny koncepty píkové kapacity a ortogonality. Vysokoúčinná kolonová kapalinová chromatografie (HPLC) a vysokoúčinná kapilární elektroforéza (HPCE) jsou zde chápány jako nejvhodnější jednorozměrné kapalinově-separační techniky pro realizaci vícerozměrných separací v kapalné fázi, jelikož s nimi lze realizovat automatizované provedení vícerozměrné separace navíc s možností on-line spojení s hmotnostní spektrometrií. V experimentální části je popsána konstrukce zjednodušeného miniaturizovaného kapalinového chromatografu. Původní koncept byl rozšířen o možnosti přípravy gradientů mobilní fáze. Funkce systému byla demonstrována na gradientové separaci směsi alkylfenonů, peptidů z tryptického digestu BSA a směsí nitrolátek. Popsaný LC systém byl použit jako základ několika dvourozměrných separačních platforem. Realizována byla HILIC-MALDI-MS analýza glykanů, dvourozměrná separace peptidů z tryptického digestu BSA využívající off-line spojení kapilární izoelektrické fokusace s vyvinutým gradientovým miniaturizovaným LC systémem a platforma umožňující realizaci on-line dvourozměrné kapalinové chromatografie v módech IEC×RPLC, RPLC×RPLC a HILIC×RPLC. Prezentované výsledky podporují správnost uvažovaného konceptu.
|
|
| |
|
|
Analýza kaseinů kravského mléka kapilární elektroforézou
Dvořáková, Irena ; Zemanová, Jana (oponent) ; Vespalcová, Milena (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá stanovením kaseinů v lyofilizovaných vzorcích mléka, přičemž byla používána metoda kapilární elektroforézy (CE). Ta již byla optimalizována a ověřena v diplomové práci Ivany Mičíkové z roku 2009. Teoretická část diplomové práce se věnuje chemickému složení kravského mléka, zvláštní kapitola pojednává o kaseinech samotných a o jejich využití v potravinářských i nepotravinářských oborech. V práci jsou dále popsány faktory, které mají vliv na skladbu mléka a na konci je uveden popis a princip kapilární elektroforézy a přehled metod CE, které byly v posledních letech využity pro stanovení kaseinů. Experimentální část se zaměřuje na popis přípravy roztoků, postup při izolaci kaseinů a při samotných analýzách. Dále shrnuje uspořádání pokusu, odběr a zpracování vzorků a složení krmných směsí. Tato diplomová práce vznikla na základě spolupráce mezi Ústavem chemie potravin a biotechnologií Fakulty chemické, Vysokého učení technického v Brně a Výzkumným ústavem pro chov skotu, s.r.o., Oddělení fyziologie výživy zvířat, v Pohořelicích.
|
host ::
RSS.