|
Rekombinantní aspartátové proteasy krev sajících parazitů
Váchová, Jana ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce)
Krev sající parazité klíště obecné Ixodes ricinus a krevnička střevní Schistosoma mansoni produkují trávicí aspartátovou proteasu typu katepsinu D, která zahajuje degradaci hemoglobinu, jež je jejich hlavním potravním zrojem. Pro katepsin D z I. ricinus (IrKatD) byl sestaven a optimalizován protokol pro refolding rekombinantního enzymu a byl určen způsob aktivace IrKatD, při níž zymogen odštěpuje propeptid auto-aktivačním mechanismem v kyselém pH. Dále byly studovány funkční vlastnosti IrKatD s využitím kinetického měření v přítomnosti fluorogenního substrátu. Takto bylo určeno pH optimum, substrátová a inhibiční specificita IrKatD. V práci byla dále popsána příprava dvou izoenzymů rekombinantního katepsinu D ze S. mansoni (SmKatD). Pro jejich produkci byl použit expresní systém E. coli. Produkované proteiny byly izolovány z inkluzních tělísek pomocí afinitní chromatografie za denaturačních podmínek a byl sestaven a optimalizován protokol pro jejich refolding. Studované aspartátové proteasy jsou zajímavé z medicinálního pohledu: inhibitory SmKatD představují potenciální chemoterapeutika pro léčbu schistosomosy a IrKatD je perspektivní antigen pro vývoj nových protiklíštěcích vakcín.
|
|
Molekulární charakterizace NADPH oxidázy ve střevě klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
KUČERA, Matěj
Tato bakalářská práce je zaměřena na charakterizaci duální oxidázy (DUOX), člena rodiny NADPH oxidáz, která byla popsána jako hlavní faktor epiteliální imunity ve střevě modelového organismu Drosophila melanogaster. Charakterizovali jsme ortolog genu pro DUOX u klíštěte I. ricinus a popsali jeho tkáňový expresní profil. DUOX je exprimován hlavně ve střevě nenasátých klíšťat a zdá se, že je jeho exprese snížena během umělé antimikrobiální infekce. Byl připraven rekombinantní protein fragmentu DUOX a připraveny antiDUOX protilátky pro pozdější charakterizaci enzymu. Naším hlavním záměrem je zdůraznit důležitost reaktivních kyslíkových radikálů produkovaných DUOX a roli klíštěcí DUOX v obraně proti patogenům ve střevě.
|
| |
|
Rekombinantní cysteinové peptidasy klíšťat
Srba, Jindřich
Rekombinantní cysteinové peptidasy klíšťat Jindřich Srba Abstrakt Intracelulární proteolýza krevních proteinů je zásadním fyziologickým procesem u klíšťat. U klíštěte Ixodes ricinus jsou cysteinové peptidasy, katepsiny B a L, součástí multi-peptidasového komplexu střev. Tato diplomová práce se zabývá přípravou rekombinatních prokatepsinů B a L a charakteristikou funkčních a biochemických vlastností katepsinů B a L. Po expresi prokatepsinů B a L v E. coli a jejich purifikaci z inkluzních tělísek afinitní chromatografií se hledala základní strategie, která by umožnila dosáhnout úspěšného refoldingu. Vhodným typem refoldingu se ukázal pro oba studované prokatepsiny "bazický" refolding. Oba prokatepsiny byly auto-aktivovány v kyselém prostředí pH 4,0; katepsin B (nikoli katepsin L) také při pH 5,5. Byla určena závislost aktivity na pH, substrátová a inhibiční specificita. Optimální pH pro hydrolytickou aktivitu katepsinů B a L byla v rozmezí 4,5 - 5,5 a 3,0 - 3,5. Oba enzymy byly blokovány skupinovým inhibitorem cysteinových peptidas a každý z nich specifickým inhibitorem navrženým pro savčí katepsiny B a L. Výsledky této diplomové práce ukazují, že katepsiny B a L produkované ve střevě klíštěte I. Ricinus vykazují výraznou exo- resp. endo-petidasovou aktivitu, což potvrzuje jejich předpokládanou úlohu v...
|
| |
|
Charakterizace defensinu klíštěte \kur{Dermacentor marginatus}
LEŠTINOVÁ, Kateřina
Antimikrobiální peptidy (AMPs), které jsou součástí imunitního systému klíšťat a dalších žijících organismů, jsou schopné eliminovat patogenní organismy. Defensiny jsou u klíšťat nejdůležitější skupinou AMPs. V této práci byl studován defensin z klíštěte D. marginatus. Gen pro defensin byl izolován z nasátých samic D. marginatus. Pomocí RT-PCR byla detekována genová exprese ve slinných žlázách a ve střevě. Rekombinantní protein byl připraven v prokaryontním expresním systému, purifikován a testován pro svou antimikrobiální aktivitu. Byly připraveny specifické polyklonální králičí protilátky (anti DR IgG) a byla testována jejich specifita i sensitivita.
|
| |
|
Příprava rekombinantního inhibitoru serinových proteáz z klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
VLNOVÁ, Ivana
Inhibitory serinových proteáz klíšťat mohou být díky jejich vlastnostem a funkcím vhodnými kandidáty na vakcínu proti klíšťatům. Cílem této práce bylo připravit rekombinantní inhibitor serinových proteáz z klíštěte Ixodes ricinus v bakulovirovém expresním systému. Pro tento účel byly vybrány dva proteiny z nadrodiny serpinů a transformovány do plazmidů. Jeden rekombinantní protein byl exprimován v bakulovirovém expresním systému, následně byl přečištěn a byla provedena jeho biochemická analýza.
|
|
IrAM4: Partial characterisation of a molecule similar to \recke{alpha}\dindex{2}-macroglobulin from a tick \kur{Ixodes ricinus}
ABSOLONOVÁ, Markéta
Ixodes ricinus is a hard tick that can transmit several diseases that are capable of affecting humans. Among those are tick-borne encephalitis and Lyme disease. The focus of this work is on IrAM4, a member of tick ?2-macroglobulin family (?2M-F) of proteins which belong to the evolutionarily oldest constituents of the innate immune system. ?2-macroglobulins are protease inhibitors and act primarily in inactivation of proteases secreted by invading pathogens within their infection cycle. The aim of this study was to identify ?2-M of Ixodes ricinus (IrAM4) from corresponding ortholog of protein ?2-M named IsAM4 present in the genome of closely related Ixodes scapularis. The partial sequence was determined by amplification of cDNA and subsequent sequencing of PCR products. RT-PCR tissue profiling revealed that IrAM4 is present in ovaries and salivary glands but not in the tick gut. The recombinant fragment of IrAM4 was afterwards prepared for immunization of a rabbit and the obtained polyclonal antibodies were used for Western blot analysis. The results showed that IrAM4 is mainly present in the hemolymph and probably in salivary glands and ovaries but it is not expressed in the gut. The native IrAM4 seems to be composed of two disulfide bound subunits. However, the exact structure of the molecule was not analyzed in this work.
|
|
IrAM9 - a member of a thioester-containing protein family from the hard tick \kur{Ixodes ricinus}
RATHNER, Petr
The thioester-containing proteins (proteins of ?2-macroglobulin family) are constituents of innate immunity, which comprise (i) universal protease inhibitors of ?2M type, (ii) C3, C4, C5 components of the complement system, (iii) insect thioester-contaning proteins (iTEPs) and (iv) macroglobulin complement related proteins (MCR). In this work, the partial structure of the thioester-containing protein from the hard tick Ixodes ricinus (IrAM9) which belong to the MCR was determined by sequencing and cloning of PCR products. The IrAM9 message is expressed in the ovaries and salivary glands of partially engorged females. Received recombinant protein was used to get polyclonal serum which was obtained by repeated rabbit immunization. The obtained antibodies were used in an attempt to detect the native protein in tick tissues by immunoblotting method.
|
host ::
