| |
|
Charakterizace cystatinu z klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
PERNER, Jan
In numerous organisms, proteases and their proteinaceous inhibitors constitute a major defence mechanism. As vectors are in constant touch with pathogens their proteolytic activity is of crucial importance. In Ixodes ricinus (IR), the main vector of Lyme disease in Europe, the midgut cells process bloodmeal particles as well as provide a major barrier to a pathogen invasion. Tick salivary secretion plays a indispensable role in both bloodmeal completion and inadvertant pathogen transmission. This thesis describes 3 IRcystatins, cysteine protease inhibitors, using standard biochemical and molecular protocols. Moreover, this work provides evidence that cystatin 3 is likely to be involved in gut processes. This study also highlights recent knowledge on tick physiology during blood-feeding.
|
| |
|
Prolylendopeptidasa z klíštěte Ixodes ricinus
Petrvalská, Olívia ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Klíšťata jsou významnými parazity a vektory patogenů. Na území České republiky je klíště obecné (Ixodes ricinus) nejrozšířenějším druhem, který přenáší lymskou boreliózu a klíšťovou encefalitidu. Proteasy klíšťat jsou potenciální molekulární cíle pro vývoj nových vakcín proti těmto parazitům. Tato práce se zaměřuje na biochemickou analýzu prolylendopeptidasy z klíštěte obecného, která dosud nebyla studována. Prolylendopeptidasa byla detekována v extraktu ze střevní tkáně klíštěte pomocí jednak měření enzymové aktivity a dále vizualizací na elektroforéze SDS-PAGE metodou fluorescenčního afinitního značení. Prolylendopeptidasa se pravděpodobně účastní procesu proteolytického trávení krevních proteinů, protože její specifická aktivita byla nejvyšší ve střevní tkáni a tato aktivita vzrůstala v průběhu procesu sání a zpracování potravy. Biochemická analýza ukázala, že enzymová aktivita prolylendopeptidasy je (1) závislá na volném cysteinovém zbytku v blízkosti aktivního místa, (2) optimální v oblasti pH 8-9, (3) selektivně inhibována peptidovými inhibitory Z-Ala-Pro-CMK a Z-Pro-Pro-CHO. Klíčová slova: prolylendopeptidasa, proteolýza, enzymová aktivita, substrátová specifita, klíště
|
|
Katepsin L z klíštěte obecného: analýza proteolytické aktivity a její regulace
Talacko, Pavel ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Klíště obecné (Ixodes ricinus) je parazit sající krev, jehož význam spočívá v přenosu patogenů způsobujících klíšťovou encefalitidu nebo lymskou boreliosu. Při trávení proteinů z krve hostitele hrají důležitou roli katepsinové proteasy. Tyto proteiny jsou zajímavé jako antigeny pro vývoj protiklíštěcích vakcín. Tato práce se zabývá katepsinem L z klíštěte obecného, konkrétně isoenzymy IrCL1 a IrCL3. IrCL1 byl exprimován v kvasinkách Pichia pastoris a chromatograficky purifikován z expresního media. Byla určena substrátová specifita IrCL1 pomocí štěpení (a) peptidových fluorogenních substrátů, (b) proteinových substrátů analyzovaných hmotnostní spektrometrií. Proteolytická aktivita IrCL1 byla modulována interakcí s glykosaminoglykany, která ovlivňuje aktivitní pH optimum. Dále byl připraven proteolyticky aktivní mutant IrCL1 s redukovaným počtem N-vázaných oligosacharidů vhodný pro krystalizační experimenty. IrCL3 byl exprimován v Escherichia coli, refoldován a aktivován do funkční formy. Proteolytická aktivita IrCL3 v řadě aspektů připomíná IrCL1 včetně substrátové specifity, kyselého pH optima a modulační interakce s glykosaminoglykany. Klíčová slova: cysteinové proteasy, katepsin L, klíště Ixodes ricinus, substrátová specifita, proteolytická aktivita
|
| |
| |
| |
| |
|
Ricinusin - nový antimikrobiální peptid z klíštěte \kur{Ixodes ricinus}: třetí člen rodiny klíštěcích obranných proteinů bohatých na histidin.
DORŇÁKOVÁ, Veronika
Nový gen kódující antimikrobiální protein {--} ricinusin {--} byl charakterizován u klíštěte I. ricinus. Získaná 405 bp dlouhá cDNA obsahuje jeden čtecí rámec (135 aminokyselin), který kóduje protein velký 14.5 kDa s 19 aminokyselin dlouhou signální sekvencí. Diferenciální exprese ricinusinu byla indukována sáním u larvy, nymfy i dospělců. Výrazná exprese tohoto genu ve slinných žlázách a ve střevě ukázala, že ricinusin se podílí na širokém spektru imunitních reakcí. Analýza genomové sekvence ricinusinu neprokázala přítomnost intronů. Pro studium antimikrobiální aktivity ricinusinu a jeho účinnost proti zmíněným patogenům, včetně infekce bakterií Borrelia burgdorferi, byl za použití bakteriálního expresního systému získán rekombinantní protein. Analýza proteinové sekvence ricinusinu prokázala přítomnost unikátní HEAHEAHEA repetice a podobnost ricinusinu k antimikrobiálním peptidům (AMPs) z klíštěte Boophilus microplus a Amblyomma hebraeum se stejnými vlastnostmi. Ricinusin se tímto stal třetím členem nové rodiny klíštěcích obranných peptidů bohatých na histidin.
|
host ::
