|
|
Metody uchování spermatu trubců včely medonosné: testování kvality uchovávaných spermií pomocí průtokové cytometrie.
Savvulidi, Filipp ; Titěra, Dalibor (vedoucí práce) ; Jan, Jan (oponent)
Hodnocení kvality spermií je nezbytnou metodou pro efektivní uchovávání trubčího spermatu. V praxi se hodnotí životaschopnost spermií pomocí testů zaměřených na posuzování strukturální a funkcionální integrity jejich plazmatické membrány. Pro hodnocení strukturální (fyzikální) integrity membrány se používají specielní fluorescenční látky, které vnikají do vnitra poškozených buněk a obarvují jejích DNA. Reakce spermií na hypoosmotické prostředí (tzv. HOS test) se používá pro vyhodnocení funkcionální (biochemické) integrity membrán. Tyto testy jsou primárně založeny na technice mikroskopického pozorování. Mikroskopické techniky jsou časově náročné, subjektivní a nepřesné. Naopak, průtoková cytometrie (což je modifikace fluorescenční mikroskopie) je velice rychlá, plně automatická, objektivní a přesná. V dnešní době průtokové cytometry již přestávají být striktně vědeckými přístroji a velmi úspěšně jsou využívány v oboru reprodukce hospodářských zvířat (a to nejenom pro účel sexování sperma). Navzdory výhodám a velkému potenciálu průtoková cytometrie zatím není rutinní metodou ve včelařském vědeckém výzkumu. Zavedení průtokové cytometrie do běžné včelařské výzkumné praxe by bylo velmi přínosné a to hlavně pro vývoj žádoucí metodiky dlouhodobého uchovávání trubčího sperma. Cílem předložené práce je zavedení a optimalizace metody průtokové cytometrie pro účel rutinní hodnocení kvality trubčího spermatu. Pro tento účel jsem vyvinul jednoduchý test simultánního hodnocení strukturální a funkcionální integrity plazmatické membrány spermií za pomoci průtokového cytometru. Ve výše popsaném testu jsem použil nové fluorescenční barvivo DRAQ7, které již bylo úspěšně aplikováno pro hodnocení kvality spermií některých hospodářských zvířat. Toto barvivo je netoxickou alternativou ke konvenčně používanému jadernímu barvivu propidium iodidu. Barvení spermií pomocí DRAQ7 předcházelo cytometrické analýze vzorků trubčích spermií vystavených HOS testu. Hypoosmotický test již od 80. let 20 století je běžně používanou metodou určenou k posouzení funkcionální integrity plasmatické membrány spermií u savců. Avšak u včel tento velmi jednoduchý a rychlý test není stále rozšířen. Ukázalo se, že kombinace obou metodik (barvení jádra barvivem DRAQ7 a HOS test) představuje velice hodnotný nástroj pro rychlé a přesní cytometrické vyhodnocení kvality trubčího spermatu.
|
host ::
RSS.