|
|
Biosyntéza terpenických sekundárních metabolitů u termitů
Jungwirth, Daniel ; Heidingsfeld, Olga (vedoucí práce) ; Buček, Aleš (oponent)
Terpenoidy jsou nejbohatší skupinou přírodních látek, které se vyskytují v podobě desítek tisíc rozmanitých molekul napříč různými formami života, od mikroorganismů přes rostliny až po živočichy. Terpenoidy nalézáme také u hmyzu, druhově nejpočetnější živočišné skupiny, kde zastávají úlohu zejména v komunikaci a chemické obraně. Ve srovnání s bohatými znalostmi o biosyntéze terpenoidůu rostlin jsou naše vědomosti o biosyntetickém původuterpenoidů u hmyzu velmi kusé a pocházejí vesměs z výzkumu posledních několika let. Tyto nové poznatky ukazují, že schopnost biosyntézy terpenoidů se vyvinula opakovaně a nezávisle u jednotlivých vývojových linií hmyzu a že hmyzí terpensynthasy vznikají prostřednictvím neofunkcionalizace genů, které byly původně zodpovědné za produkci isoprenylpyrofosfátů, a jejich následnou funkční diverzifikací. Mezi ostatními skupinami hmyzu vyčnívají termiti, kteří využívají širokou škálu isoprenoidů pro komunikaci a unikátní chemickou obranu. Nicméně vznik terpenoidních látek u termitů je stále neznámý. Tato práce se zabývá funkční charakterizaci tří domnělých terpensynthas termita druhu Nasutitermes takasagoensis. Exprese vybraných proteinů probíhala ve dvou bakteriálních systémech a pro jejich purifikaci byla použita metoda afinitní chromatografie na vázaných kovových iontech....
|
|
|
Vacuolar aspartic protease of Candida albicans
Hirko, Dominik ; Heidingsfeld, Olga (vedoucí práce) ; Dostál, Jiří (oponent)
Aspartátové proteázy (AP) mají zásadní význam pro různé buněčné procesy. Tato diplomová práce se zabývá problematikou exprese a charakterizace vakuolární aspartátové endoproteasy Apr1p z Candida albicans a srovnává ji s jejím orthologem Pep4p ze Saccharomyces cerevisiae. Rekombinantní exprese Apr1p v Escherichia coli poskytla neaktivní proenzym, proApr1p. Rozsáhlé snahy o aktivaci nevedly k maturaci Apr1p, což naznačuje závislost aktivace na posttranslačních modifikacích, jako je glykosylace a specifické interakce s jinými proteázami podobně jako u Pep4p. Pokusy o využití vakuolárních enzymů nebo buněčných lyzátů k aktivaci proApr1p byly také neúspěšné, což může být způsobeno křehkostí izolovaných vakuol a komplexní směsí enzymů v buněčných lyzátech ztěžjucií analýzu aktivace. Tyto problémy podtrhují složitou povahu aktivace proteas kdy ani různe in vitro techniky nedokážou simulovat in vivo aktivaci proteas. Slibné výsledky se však objevily u heterologní exprese proApr1p v Saccharomyces cerevisiae, kde frakcionovaný buněčný lyzát vykazovaly specifickou proteolytickou aktivitu při kyselém pH po inhibici jiných proteáz. To by mohlo naznačovat, že Apr1p může být produkován v aktivní formě v rámci eukaryotického systému, nicméně je třeba dále zkoumat jeho purifikaci. Experiment s reciproční výměnou...
|
|
|
Studium vazebné interakce tyrosinkinasových inhibitorů se sérovým albuminem
Rodová, Marie ; Indra, Radek (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
jsou protinádorová léčiva užívaná k léčbě pacientů s karcinomem štítné žlázy v případě vandetanibu a v případě sunitinibu pro pacienty renálním buněčným karcinomem, gastrointestinálním stromálním tumorem a nádorem slinivky břišní. Patří do skupiny tyrosinkinasových inhibitorů a jejich aktivita spočívá antiangiogenních účincích a inhibici proliferace a přežití nádorových buněk prostřednictvím VEGFR a u vandetanibu ještě navíc prostřednictvím EGFR a RET. V předkládané diplomové práci byla studována vazebná interakce sérového albuminu TKI sunitinibem a vandetanibem za použití BSA, HSA a krevní plasmy. Kromě rozdílu různými sérovými albuminy (čistý B čistý H i povaha a lokalizace vazebné interakce. Dále byl studován vliv přítomnost dalších ligandů a fotosenzitivita samotného sunitinibu. Za použití spektroskopických metod, jako je UV VIS absorpce nebo fluorescenční zhášení, byly stanoveny Stern BSA a HSA. Data zhášení VIS absorpce naznačovaly tvorbu komplexu BSA je dostačující pro účinný přenos léčiva do jeho specifického cílového místa prostřednictvím krevního oběhu. Silná vazebná afinita byla potvrzena i metodou HPLC za použití centrifugačních filtrů. Z termodynamických parametrů bylo pro oba TKI při vazbě SA i BSA předpovězeno primární zapojení hydrofobních interakcí. Data zhášení přítomnosti markerů...
|
|
|
Phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2α by alternative phosphate sources catalyzed by heme-regulated kinase: kinetic analysis
Ovad, Tomáš ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
diplomová práce Ing. Bc. Tomáš Ovad Fosforylace eukaryotického iniciačního faktoru 2α alternativními zdroji fosfátu katalyzovaná kinasou regulovanou hemem: kinetická analýza Tato diplomová práce je zaměřena na fosforylaci eukaryotického iniciačního faktoru 2α (eIF2α) inhibitorem regulovaným hemem (HRI), která je klíčovou reakcí v regulaci eukaroytické pro- teosyntézy. V předešlých studiích byly stanoveny kinetické parametry této reakce v přítomno- sti ATP jako donoru fosfátu. Nebyla však studována možnost využití alternativních NTP (GTP, UTP, CTP) jako zdrojů fosfátu pro tuto reakci. V této diplomové práci byl hetero- logní expresí v E. coli získán wild-type enzym HRI a byla studována jeho kinasová aktivita v přítomnosti ATP, GTP, UTP a CTP. Byly určeny kinetické parametry a střední inhibiční koncentrace hemu pro reakci katalyzovanou HRI v přítomnosti jednotlivých NTP jako zdrojů fosfátu. Pro validaci těchto kinetických experimentů byly vyloučeny kontaminace ATP v roz- tocích GTP, UTP a CTP pomocí iontově párové chromatografie. Ukázalo se, že ačkoli ATP je nejefektivnějším zdrojem fosfátu pro kinasovou aktivitu HRI, i zbývající NTP (GTP, UTP, CTP) mohou být v dané reakci využity jako donory fosfátu. Tato...
|
|
|
Antagonistic regulation by global transcription factors Tup1p, and Cyc8p of Flo11 and Flo11 -dependent phenotypes in wild yeast
Nguyen Van, Phu ; Palková, Zdena (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent) ; Malcová, Ivana (oponent)
Biofilmy jsou běžným způsobem růstu kvasinek, ve kterém buňky přilnou k sobě navzájem a přilnou k abiotickým povrchům za vzniku komplexních mnohobuněčných struktur. Společný život v biofilmech poskytuje buňkám množství výhod ve srovnání s planktonním způsobem růstu. Mezi ně patří především ochrana před vlivy vnějšího prostředí a rezistence. Biofilmy se nacházejí v mnoha prostředích a hrají důležitou rolí v průmyslu. Biofilmy však mohou být také velmi nebezpečné v klinických podmínkách. Existuje tedy velký zájem o studium biofilmů a o jejich eliminaci. V této práci jsme použili biofilm divokých kvasinek Saccharomyces cerevisiae jako ideální systém pro zkoumání potenciálních funkcí kvasinkového Cyc8-Tup1 transkripčního corepresorového komplexu při regulaci buněčné adheze a tvorby biofilmu na agarovém živném médiu a na rozhraní pevná látka-kapalina. Zjistili jsme, že, oproti původnímu očekávání, Cyc8p a Tup1p antagonisticky kontrolují tvorbu strukturovaných biofilmových kolonií na agaru a expresi genu FLO11. Samotný Cyc8p působí jako klíčový represor FLO11, zatímco Tup1p podporuje tvorbu kolonií biofilmu a indukuje expresi FLO11 inhibováním represivní funkce Cyc8p a prevencí degradace Flo11p pravděpodobně mechanismem zahrnujícím inhibici extracelulární proteázy. Navíc Cyc8p a Tup1p antagonisticky...
|
|
|
Produkce a charakterizace lidského inhibitoru C1 a rekombinantních proteinů z Plasmodium falciparum PfMSP3.1 pro strukturní studia
Čápová, Kateřina ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
PfMSP3.1 je jedním z povrchových proteinů intracelulárního parazita Plasmodium falciparum, který způsobuje malárii. Protein v rámci strategie úniku parazita před imunitním systémem lidského hostitele váže jeden z regulátorů systému komplementu - C1 inhibitor. Zjištění přesného místa vazby a jeho strukturální stanovení by napomohlo k pochopení interakce mezi parazitem a hostitelem, která je důležitá pro rozvoj nemoci, a tím i pro návrh možné terapie. V teoretické části práce je přiblížen životní cyklus Plasmodia falciparum, role vývojového stádia parazita zvaného merozoit, jeho povrchových proteinů a s tím i přímo merozoitového povrchového proteinu 3 při napadání červených krvinek parazitem. Dále je v ní stručně popsán systém komplementu, jeho aktivace a regulace. Experimentální část zahrnuje klonování plasmidů pro tvorbu C1 inhibitoru a různých forem povrchového proteinu merozoitu PfMSP3.1, transfekci S2 hmyzích buněk těmito plasmidy, následnou expresi proteinů v S2 buňkách a jejich purifikaci. V druhé polovině experimentální části byly provedeny pokusy o vytvoření komplexů C1 inhibitoru s jednotlivými formami povrchového proteinu merozoitu PfMSP3.1 a krystalizaci tohoto proteinu. Klíčová slova Proteinová exprese, inhibice enzymů, krystalizace proteinů, malárie. komplement, C1 inhibitor
|
|
|
Slepičí protilátky proti patogenní kvasince Candida albicans
Konečná, Lucia ; Heidingsfeld, Olga (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
4 Abstrakt Kvasinka Candida albicans patří mezi nejrozšířenější patogenní kvasinky. Jako oportunní patogen osídluje především sliznice hostitele a infekci způsobuje obzvlášť u jedinců s oslabeným imunitním systémem. Nejčastější infekci, způsobenou C. albicans je vaginální mykóza, s kterou se během života setkají alespoň 3 ze 4 žen. K léčbě tohoto onemocnění se využívají antimykotika, vůči kterým jsou ale kvasinky stále méně citlivé. Z tohoto důvodu je snaha vyvíjet stále nové možnosti léčby (nejen) infekcí způsobených C. albicans. Ačkoli vaginální mykóza ve většině případech není závažným onemocněním, jedná se o velmi rozšířenou infekci, která se u mnoha žen projevuje opakovaně, někdy i víckrát ročně. Protože vaginální mykóza snižuje kvalitu života mnoha žen, rozhodli jsme se zaměřit v této práci právě na toto onemocnění. V tomto projektu byly využívány slepičí protilátky, které mají oproti savčím protilátkám řadu výhod. U vejcorodých živočichů se protilátky nacházejí nejen v krevním séru, jak je tomu u savců, ale jsou také sekretovány do vajec. Díky tomu je izolace slepičích protilátek neinvazivní a etická. Navíce metody izolace protilátek z vajec jsou taky jednoduší oproti izolaci z krevního séra. V konečném výsledku jsou slepičí protilátky také ekonomičtější, protože výtěžek slepičích protilátek může být...
|
|
|
Vývoj metod pro analýzu interakce antivirotika ritonaviru s lanosterol-14- α-demethylasou patogenních kvasinek
Burdová, Tereza ; Heidingsfeld, Olga (vedoucí práce) ; Dostál, Jiří (oponent)
Ritonavir je inhibitor proteasy HIV a byl používán jako součást lékových koktejlů pro vysoce aktivní antivirovou terapii (HAART). Orofaryngeální kandidóza je jednou z nejčastějších oportunních infekcí u pacientů trpících AIDS. Ukázalo se, že pokud byli léčeni koktejly obsahujícími inhibitory proteasy HIV včetně ritonaviru, trpěli orofaryngeální kandiózou v mnohem menší míře než pacienti, jimž byly podávány léky bez proteasových inhibitorů. Důvodem může být fakt, že inhibitory proteasy HIV inhibují, byť s vysokým Ki, taktéž proteasy patogenních kvasinek. Jiným vysvětlením může být, že některé z těchto inhibitorů blokují lanosterol-14-α-demethylasu, klíčový enzym biosyntézy ergosterolu, který je důležitou součástí kvasinkových membrán. Obsahem práce je izolace mikrosomální frakce patogenních kvasinek Candida albicans a Candida parapsilosis a optimalizace metod pro analýzu inhibice kvasinkové lanosterol-14-α-demethylasy ritonavirem. Klíčová slova: ritonavir, Candida albicans, Candida parapsilosis, lanosterol-14-α- demethylasa, mikrosomální frakce
|
|
|
Trk1 Potassium Importers - key transport systems for yeast cell fitness and stress tolerance
Masaryk, Jakub ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent) ; Malínský, Jan (oponent)
Jedním z klíčových předpokladů pro dělení kvasinkových buněk je příjem základních živin a iontů, jako je draslík. Draslík je důležitý, monovalentní kation a jeho dostatečná intracelulární koncentrace je rozhodující pro různé procesy, například regulaci membránového potenciálu a buněčného turgoru, enzymatickou aktivitu a syntézu proteinů. Dostatečná vnitřní koncentrace draslíku je také jedním z klíčových signálů pro buněčné dělení. Nicméně protože také přebytek draslíku může vést k nepříznivým fyziologickým důsledkům v kvasinkách, jako jsou deacidifikace vakuol a depolarizace plazmatické membrány, je pro kvasinkové buňky nezbytné, aby celý proces získávání draslíku byl přísně regulován, aby se udržela jeho správná homeostáze. V kvasinkách Saccharomyces cerevisiae je za klíčového hráče v příjmu draslíku považován uniportér Trk1. Cílem předkládané disertační práce bylo získat nové poznatky týkající se proteinu Trk1, konkrétněji studovat jeho schopnost modifikovat vlastní kapacitu pro příjem draslíku, regulaci pomocí fosforylace a také zapojení do přežití buněčné smrti vyvolané glukózou (GICD). Dále byly také charakterizovány systémy příjmu draslíku u vybraných nekonvenčních, kvasinkových druhů. Nejvýraznějším rysem Trk1 je jeho schopnost přepínat mezi dvěma afinitními stavy, nízko- a vysoce-afinitní...
|
|
|
Development and differentiation of different types of yeast colonies: Regulation of metabolic diversification and development of cells with novel properties
Maršíková, Jana ; Palková, Zdena (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent) ; Demnerová, Kateřina (oponent)
Kvasinky jsou jednobuněčné organismy, ale na pevném substrátu jsou schopny vytvářet složité organizované struktury, které se chovají jako primitivní mnohobuněčné organismy. Příkladem těchto struktur jsou kolonie a biofilmy, jejichž buňky spolu vzájemně interagují, koordinují svůj růst a vývoj, prostorově se diferencují a vytvářejí specializované buněčné subpopulace, v nichž se uplatňují specifické procesy a regulační dráhy. Základem buněčné diferenciace a specializace je tvorba gradientů živin, metabolitů a signálních molekul. Mnohobuněčná kvasinková společenstva se tak svými vlastnostmi výrazně liší od planktonních populací. Cílem této práce je rozšířit znalosti týkající se vývoje a diferenciace hladkých i strukturovaných kolonií kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Do literárního úvodu práce je zařazen přehled současných poznatků o vývoji kvasinkových kolonií a biofilmů, zejména u S. cerevisiae, a jsou zde uvedeny i vybrané regulace důležité pro vznik mnohobuněčných populací. Práce přináší poznatky o antagonistické funkci transkripčních regulátorů Cyc8p a Tup1p při vývoji strukturovaných kolonií biofilmu. Celogenomové transkriptomické analýzy různých buněčných subpopulací hladkých kolonií přispěly k objasnění procesů, regulačních mechanismů a dějů, které jsou specifické pro jednotlivé buněčné...
|
host ::
RSS.