|
|
Functional analysis of the TSSC4 chaperone during snRNP formation
Vojáčková, Jitka ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Vaňková Hausnerová, Viola (oponent)
Sestřih je proces, během kterého jsou nekódující sekvence (introny) vystřiženy z pre-mRNA a exony spojeny. Celý tento proces je katalyzován multi-megadaltonovým sestřihovým komplexem, který se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových částic (zkráceně snRNP částice), jenž každá obsahuje svoji vlastní malou jadernou RNA a sadu proteinů specifických pro každou částici. Během biogeneze snRNP částic jsou U4 a U6 snRNP částice spojeny za vzniku di-snRNP částice, která je dále asociována s U5 snRNP částicí a tím dává vzniku tri-snRNP. S pomocí hmotnostní spektrometrie jsme nalezly dříve necharakterizovaný protein interagující s U5 snRNP částicí, zvaný TSSC4. S použitím imunoprecipitace jsem potvrdila specificitu TSSC4 pro U5 snRNP a nalezla oblast TSSC4 zodpovědnou za interakci s U5 snRNP. Nezávisle na U5 snRNP částici, TSSC4 interaguje s PRPF19, komponentem komplexu, který se účastní katalytické aktivace sestřihového komplexu. Snížení koncentrace TSSC4 v HeLa buňkách způsobuje akumulaci di-snRNP specifických RNA a U5 snRNP částice v Cajalových tělískách, jaderných organelách důležitých pro biogenezi snRNP částic. Podobný fenotyp byl dříve pozorován po zastavení tvorby tri-snRNP částice. Abych otestovala důležitost TSSC4 pro vznik tri-snRNP, pomocí gradientové ultracentrifugace jsem rozdělila...
|
|
|
Spliceosome assembly
Hausnerová, Viola ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Chalupníková, Kateřina (oponent)
Introny jsou vystřiženy z eukaryotických transkriptů a exony jsou spojeny dohromady během procesu zvaného sestřih pre-mRNA. Sestřih je katalyzován sestřihovým komplexem. Jedná se o velký ribonukleoproteinový komplex složený z pěti malých jaderných RNA a více než stovky proteinů. Tento komplex rozpoznává 5' sestřihové místo, místo větvení a 3' sestřihové místo a následně provádí dvě transesterifikační reakce, jejichž výsledkem je zralá molekula mRNA. V rámci časného sestřihového komplexu je 5' sestřihové místo definováno pomocí U1 snRNP a na rozpoznání místa větvení a 3' sestřihového místa se podílí U2 pomocný faktor (U2 auxiliary factor, U2AF). Spolupráce sestřihových míst byla částečně popsána in vitro, ale situace in vivo není dosud zcela objasněna. V této studii jsme použili fluorescenční rezonanční energetický transfer (Fluorescence resonance energy transfer, FRET) a RNA imunoprecipitaci (RIP) k popsání časných kroků skládání sestřihového komplexu. Abychom detekovali interakce proteinů na RNA molekule přímo v buněčném jádře, uplatnili jsme sestřihové reportéry kódující -globinový gen a vlásenky z fága MS2. Výsledky FRETu ukazují, že intaktní 5' sestřihové místo je vyžadováno pro vazbu U2AF35 na 3' sestřihové místo a že vazba U1C je částečně omezena v přítomnosti mutace 3' sestřihového místa. Dále jsme...
|
|
| |
|
|
Functional analysis of the TSSC4 chaperone during snRNP formation
Vojáčková, Jitka ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Vaňková Hausnerová, Viola (oponent)
Sestřih je proces, během kterého jsou nekódující sekvence (introny) vystřiženy z pre-mRNA a exony spojeny. Celý tento proces je katalyzován multi-megadaltonovým sestřihovým komplexem, který se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových částic (zkráceně snRNP částice), jenž každá obsahuje svoji vlastní malou jadernou RNA a sadu proteinů specifických pro každou částici. Během biogeneze snRNP částic jsou U4 a U6 snRNP částice spojeny za vzniku di-snRNP částice, která je dále asociována s U5 snRNP částicí a tím dává vzniku tri-snRNP. S pomocí hmotnostní spektrometrie jsme nalezly dříve necharakterizovaný protein interagující s U5 snRNP částicí, zvaný TSSC4. S použitím imunoprecipitace jsem potvrdila specificitu TSSC4 pro U5 snRNP a nalezla oblast TSSC4 zodpovědnou za interakci s U5 snRNP. Nezávisle na U5 snRNP částici, TSSC4 interaguje s PRPF19, komponentem komplexu, který se účastní katalytické aktivace sestřihového komplexu. Snížení koncentrace TSSC4 v HeLa buňkách způsobuje akumulaci di-snRNP specifických RNA a U5 snRNP částice v Cajalových tělískách, jaderných organelách důležitých pro biogenezi snRNP částic. Podobný fenotyp byl dříve pozorován po zastavení tvorby tri-snRNP částice. Abych otestovala důležitost TSSC4 pro vznik tri-snRNP, pomocí gradientové ultracentrifugace jsem rozdělila...
|
|
|
Gene regulation in four dimensions
Vaňková Hausnerová, Viola ; Lanctôt, Christian (vedoucí práce) ; Převorovský, Martin (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Zobrazování transkripce na úrovni jednotlivých buněk prokázalo, že se jedná o proces, který neprobíhá souvisle, ale přerušovaně. K tomuto pozorování, které bylo zaznamenáno u celé řady organizmů sahající od bakterií k savčím buňkám, se vztahuje nyní hojně využívaný termín transkripční pulzování. Dynamika transkripčního pulzování je ovlivněna jak rysy vlastními samotnému procesu transkripce, tak nadřazenými faktory jako je prostředí chromatinu, signální molekuly nebo fáze buněčného cyklu. V první části této práce jsme se zaměřili na regulaci transkripčního pulzování v jadérku. Pomocí mikroskopického sledování živých buněk jsme ukázali, že transkripce transgenu vloženého do jadérka a přepisovaného RNA polymerázou II probíhá v pulzech. Ve druhé části práce jsme se zabývali vztahem mezi dekondenzací chromatinu a dynamikou transkripce. Pomocí hyperosmotického média jsme indukovali globální kondenzaci chromatinu a objevili jsme, že během dekondenzace chromatinu dochází v jednotlivých živých buňkách k časově omezenému nárůstu intenzity transkripce. Dále jsme analyzovali expresi genů TFRC a POLR2A s použitím metody single molecule RNA FISH. Během omezeného období, které kolidovalo s dekondenzací chromatinu v telofázi/časné G1 fázi buněčného cyklu, jsme zaznamenali nárůst ve frekvenci i velikosti...
|
|
|
Spliceosome assembly
Hausnerová, Viola ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Chalupníková, Kateřina (oponent)
Introny jsou vystřiženy z eukaryotických transkriptů a exony jsou spojeny dohromady během procesu zvaného sestřih pre-mRNA. Sestřih je katalyzován sestřihovým komplexem. Jedná se o velký ribonukleoproteinový komplex složený z pěti malých jaderných RNA a více než stovky proteinů. Tento komplex rozpoznává 5' sestřihové místo, místo větvení a 3' sestřihové místo a následně provádí dvě transesterifikační reakce, jejichž výsledkem je zralá molekula mRNA. V rámci časného sestřihového komplexu je 5' sestřihové místo definováno pomocí U1 snRNP a na rozpoznání místa větvení a 3' sestřihového místa se podílí U2 pomocný faktor (U2 auxiliary factor, U2AF). Spolupráce sestřihových míst byla částečně popsána in vitro, ale situace in vivo není dosud zcela objasněna. V této studii jsme použili fluorescenční rezonanční energetický transfer (Fluorescence resonance energy transfer, FRET) a RNA imunoprecipitaci (RIP) k popsání časných kroků skládání sestřihového komplexu. Abychom detekovali interakce proteinů na RNA molekule přímo v buněčném jádře, uplatnili jsme sestřihové reportéry kódující -globinový gen a vlásenky z fága MS2. Výsledky FRETu ukazují, že intaktní 5' sestřihové místo je vyžadováno pro vazbu U2AF35 na 3' sestřihové místo a že vazba U1C je částečně omezena v přítomnosti mutace 3' sestřihového místa. Dále jsme...
|
|
|
Promoter-terminator interactions in eukaryotic RNA polymerase II transcription
Petr, Martin ; Hozák, Pavel (vedoucí práce) ; Vaňková Hausnerová, Viola (oponent)
Genové smyčky jsou chromatinové struktury, k jejichž vzniku dochází při fyzické interakci vzdálených oblastí DNA. Jelikož se tyto oblasti často podílejí na kontrole transkripčního cyklu, genové smyčky tvoří další úroveň regulace genové exprese. Tato práce shrnuje aktuální znalosti o genových smyčkách, přičemž se zaměřuje speciálně na smyčky vzniklé interakcemi promotorových a terminátorových oblastí genů transkribovaných pomocí eukaryotické polymerázy II. Jsou rozebrány smyčky objevené u kvasinkových genů, u savčího tumor supresoru BRCA1 a také u integrovaného genomu viru HIV-1, a to včetně mechanismů, jež pravděpodobně vedou k jejich vzniku. Jelikož byla nalezena spojitost mezi genovými smyčkami a transkripční pamětí u kvasinek, je popsán jejich fyziologický význam při tomto jevu. V souvislosti s přímým spojením BRCA1 a HIV-1 se závažnými lidskými chorobami je dále navržen obecný význam poruch ve funkci genových smyček při vzniku závažných patologických stavů. Klíčová slova: genové smyčky, chromatinové smyčky, konformace chromatinu, transkripční paměť, transkripce, genová exprese, regulace
|
|
| |
host ::
RSS.