|
|
Manipulace zárodečných buněk jako nástroj pro management a produkci izogenních linií u ryb
FRANĚK, Roman
Izogenní linie ryb představují základní možnost kontroly genetického pozadí pokusných organismů, jelikož všichni jedinci z dané izogenní linie sdílejí stejný genotyp. Izogenní linie ryb byly dosud produkovány pouze opakovanou uniparentální dědičností - androgenezí a gynogenezí. V první generaci je produkováno homozygotní potomstvo, následně každý homozygotní jedinec po opětovné indukci uniparentální dědičnosti produkuje odlišnou izogenní linii. Navzdory optimalizovaným postupům pro indukci uniparentální dědičnosti byly izogenní linie úspěšně produkovány pouze u několika druhů ryb. Jejich dlouhodobé udržování je značně problematické z důvodu nízké životaschopnosti a nepříznivých reprodukčních charakteristik. Situace je dále komplikována tím, že izogenní linie jsou zpravidla přirozeně monosexní, kdy pro další reprodukci je nutné znovu použít uniparentální dědičnosti, nebo provést zvrat pohlaví u části jedinců. V této dizertační práci bylo provedeno několik typů manipulací se zárodečnými buňkami. Byly vyvinuty a optimalizovány protokoly pro kryokonzervaci spermatogonií a oogonií za účelem maximalizace jejich životaschopnosti po rozmrazení. Fyziologická aktivita kryoprezervovaných buněk byla potvrzena transplantací do náhradního hostitele. Kryoprezervované a následně transplantované buňky si v porovnání s nezamraženou kontrolou zachovaly srovnatelnou kolonizační aktivitu, byly schopny se transdiferenciovat ze spermatogonií na oogonie. Úspěch transplantace byl následně potvrzen detekcí exprese genů spojených s gametogenezí u kapra pomocí RT-PCR. V další studii byly zárodečné buňky z homozygotních donorů kapra obecného transplantovány do náhradních rodičů - karas obecný zlatá forma, kteří byli sterilizováni pomocí tlumení exprese genu zodpovědného za vývoj a migraci zárodečných buněk. Tento postup má potenciál zvýšit šanci na produkci životaschopný gamet. Zárodečné buňky homozygotů s různým stupněm poškození gameteogeneze mohou být přeneseny do plně životaschopných hostů a tím celkově zvýšit efektivitu produkce izogenních linií. Použití karase zlatého jakožto náhradního rodiče navíc zajistí, že část chimér zárodečné linie budu samci a část samice, tím pádem budou produkovány gamety obou pohlaví a pro další reprodukci izogenní linie nebude nutné dalších zásahů, které jsou běžně nutné pro udržitelnost izogenní linie. Vhodnost triploidních recipientů pro transplantaci zárodečných buněk, kteří mohou být potenciálně použity jako recipienti pro buňky z homozygotů za účelem produkce izogenních linií, byla potvrzena u kaprovitých ryb na modelu dánia pruhovaného. Spermatogonie a oogonie z diploidních donorů byly transplantovány do uměle indukovaných triploidních larev. Po dosažení pohlavní dospělosti byly získány spermie původem z transplantovaných buněk donora. Oogonie se transdiferenciovaly do spermatogonií a byly produkovány spermie s pohlavními chromozomy samic, které mohou být zajímavé pro další studie determinace pohlaví u dánia pruhovaného. Dále byla vyvinuta nová technika pro přenos zárodečné linie linií byla vyvinuta s použitím embryí dánia pruhovaného. Buňky dárce byly transplantovány ze stádia blastuly do rozplavaných larev. S tímto přístupem byly nediferencované primordiální zárodečné buňky schopny kolonizovat genitální rýhu a zahájit gametogenezi. Po dosažení pohlavní dospělosti chimér zárodečné linie byly získány gamety a životaschopné potomstvo. Ačkoli celková účinnost této metody byla ve srovnání s jinými transplantačními metodami nižší, tato studie může mít význam pro záchranu zárodečné linie u málo životaschopných embryí nebo letálních mutantů.
|
|
|
Využití kyseliny peroctové v rybničních akvakulturách
FRANĚK, Roman
Cílem diplomové práce bylo provozně ověřit kyselinu peroctovou (KPO) pro kontrolu ektoparazitů v rybničním chovu kapra. Prvotní pokus, kdy byl zkoumán vliv běžného organického zatížení rybniční vody na rychlost rozkladu ve dvou teplotních režimech (11-15 a 21 °C), ukázal, že v rozmezí 3 až 6 hodin od aplikace KPO dochází poklesu koncentrace pod polovinu iniciační dávky (6 mg.l-1). Zároveň byly zjištěny statisticky významné rozdíly (p < 0,05) v porovnání rychlosti rozkladu mezi vzorky rybniční vody a vody organicky nezatížené (destilovaná a vodovodní) v obou teplotních režimech pokusu. Aplikace KPO v průběhu přepravy do transportních beden byla provedena na třech věkových kategoriích kapra obecného (K1, K2 a K3), kdy ryby byly po dobu 60 90 minut vystaveny 1,5 mg.l-1 KPO ve formě Persterilu 36. Parazitární vyšetření kůže a žaber prokázalo především redukci počtu protozoálních ektoparazitů (Trichodina spp. a Apiosoma spp.) vyšetřovaných jedinců ve srovnání s kontrolou. U dalších nalezených parazitů nebyla KPO účinná. Statistické vyhodnocení prokázalo signifikantní pokles (p < 0,05) prevalence pouze ve 3 případech (Trichodina spp. a Gyrodactylus spp.) z celkových 19 nálezů. Dlouhodobou 4denní koupelí kaprů s těžkým povrchovým zaplísněním v koncentraci 1,5 mg.l-1 KPO, byl zjištěn pozitivní vliv KPO na celkové přežití ryb. V kontrolní skupině došlo k úhynu všech ryb třetí den pokusu, naopak u pokusné skupiny došlo k eliminaci povrchového zaplísnění a celková mortalita dosáhla pouze 40 %. Kontinuální 14denní aplikace KPO proti ektoparazitům pomocí peristaltické pumpy se neosvědčila.
|
|
|
Hematologické změny u ryb vystavených dusitanům
FRANĚK, Roman
Cílem práce bylo zjistit vliv dusitanů na hematologické ukazatele pstruha duhového (Oncorhynchus mykiss) a tilápie Nilské (Oreochromis niloticus). Po expozici ryb různým koncentracím dusitanů, byly stanoveny hodnoty 48hLC50. Pro vlastní test byly použity zlomkové koncentrace těchto hodnot. Pro pstruha duhového 8 mg.l-1 NO2?, pro tilápii nilskou 11 mg.l-1 NO2?. Expozice u obou druhů trvala 48 hodin. Z krve ryb byly stanoveny hematologické parametry, z krevních nátěrů se stanovil vliv dusitanů na velikostní změny erytrocytů. Z krve pstruha duhového byl elektronovou mikroskopií stanoven vliv dusitanů na změny v ultrastruktuře erytrocytů. U erytrocytů pstruha duhového bylo zjištěno signifikantní (p < 0,05) zmenšení jader. Na snímcích z elektronového mikroskopu bylo prokázáno zvýšené množství změn, především v podobě různých útvarů v cytoplazmě erytrocytů, také bylo viditelné smrštění jader. Bylo zjištěno signifikantní (p < 0,01) snížení množství hemoglobinu a signifikantní (p < 0,01) zvýšení koncentrace methemoglobinu v krvi u exponované skupiny. U počtu erytrocytů a hematokritové hodnoty nebyly zaznamenány změny. Hodnocení hematologických ukazatelů tilápie nilské neprokázalo žádné velikostní změny u měřených parametrů, změny nebyly zaznamenány u počtu erytrocytů, množství hemoglobinu ani u hematokritové hodnoty.
|
host ::
RSS.