|
|
Fosfoinositidy v membránách spojených s RAB1
Růžička, Václav ; Doubravská, Lenka (vedoucí práce) ; Bouřa, Evžen (oponent)
Malé GTPázy z rodiny RAB jsou klíčovými regulátory mnoha buněčných dějů, včetně membránového transportu či autofágie. S řízením membránových pochodů jsou spjaté i fosforylované deriváty fosfatidylinositolu - fosfatidylinositolfosfáty (PIPy). Předmětem našeho zájmu jsou GTPázy RAB1A a RAB1B a jimi řízené procesy časné sekrece proteinů. S těmito ději funkčně souvisí i enzymy regulující jednotlivé fosforylované formy fosfatidylinositolu. To nasvědčuje tomu, že se i tyto lipidy jako takové podílejí na regulaci alespoň některých částí dráhy časné sekrece proteinů. Jejich role v těchto procesech však není doposud komplexněji popsána. V této bakalářské práci jsou proto shrnuty současné poznatky o fostatidylinositolfosfátech na membránách spojených s RAB1A a RAB1B, což obnáší jejich úlohu na endoplazmatickém retikulu (ER) a jeho exportních místech (ERES), na přechodném kompartmentu mezi ER a Golgiho aparátem (ERGIC) i na Golgiho aparátu samotném. Práce se specificky zaměřuje i na přímé interakce mezi GTPázami RAB1 a PIPy, případně enzymy, které PIPy regulují. Souhrnem lze konstatovat, že fosfatidylinositolfosfáty hrají podstatnou roli v průběhu časné fáze sekrece proteinů.
|
|
|
Structural studies of selected protein complexes involved in signal transduction
Honzejková, Karolína ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Bouřa, Evžen (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Protein-proteinové interakce jsou klíčové pro většinu fyziologických i patofyziologických dějů. Detailní charakterizace těchto interakcí je proto nezbytná nejen k porozumění podstaty těchto dějů, ale i pro návrh strategií, jak tyto interakce cíleně ovlivňovat. Tato práce se zaměřuje na studium struktury a interakcí několika proteinů a jejich komplexů. ASK1 (z anglického "apoptosis signal-regulating kinase 1") je mitogeny aktivovaná proteinkinasa kinasa kinasa (MAP3K), která aktivuje dráhy proteinkinas p38/JNK, čímž směruje buňky k zánětlivé reakci nebo apoptóze. ASK1 interaguje s thioredoxinem (TRX), malou dithioloxidoreduktasou, která inhibuje ASK1, nicméně mechanismus této inhibice je nejasný. CaMKK1 a CaMKK2 jsou Ca2+ /kalmodulin (CaM)- dependentní proteinkinasy, které regulují např. energetickou rovnováhu buňky, paměť či zánět. Obě jsou inhibovány proteiny 14-3-3, ale navzdory svým doménovým a sekvenčním podobnostem je rozsah inhibice zprostředkovaný proteiny 14-3-3 odlišný. Estrogenový receptor alfa (ERα) je jaderný receptor, který se podílí na vzniku rakoviny prsu. Pro léčbu tohoto onemocnění se používá tamoxifen, antagonista ERα, který však často způsobuje vznik rezistence. Proteiny 14-3-3 interagují s ERα a inhibují jeho transkripční aktivitu, povaha této interakce je však stále nejasná....
|
|
|
Structural studies of an abasic site DNA damage repair and DNA interstrand cross-link formation
Landová, Barbora ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Poškozením DNA se rozumí jakákoli změna nebo modifikace struktury DNA, která se odchyluje od jejího přirozeného stavu. Abasické místo (Ap místo) je jedním z nejčastějších poškození DNA, které vzniká spontánní depurinací/depyrimidinací nebo enzymatickým odstraněním báze. Pokud se neopraví, může vést ke genetické mutaci a potenciálně způsobit onemocnění, jako je například rakovina. Pochopení mechanismu opravy DNA je zásadní pro lékařský výzkum a aplikaci. Bakteriální MutM je glykosyláza opravující DNA, která odstraňuje poškození DNA vzniklé oxidačním stresem a zabraňuje mutacím a genomové nestabilitě. MutM patří do rodiny prokaryotických enzymů Fpg/Nei a je strukturně i funkčně podobná se svým eukaryotickým protějškům, jako jsou NEIL1-NEIL3. Zde prezentuji dvě krystalové struktury MutM z patogenní Neisseria meningitidis: MutM holoenzym a MutM vázaný na DNA. Volný enzym existuje v otevřené konformaci, zatímco po vazbě na DNA, dochází k podstatným strukturním změnám a přeskupení domén enzymu i ohybu DNA. Jednou z poškození DNA opravovaných MutM je Ap místo, které, pokud není opraveno, může spontánně vést k vytvoření mezivláknového kovanetního prokřízení DNA (Ap-ICL) se sousedním adeninem na opačném vlákně DNA. Je známo, že glykosyláza NEIL3 odstraňuje Ap-ICL. Pomocí série různých oligonukleotidů jsme...
|
|
|
Biofyzikální charakterizace inhibice koronavirové nsp14 malými molekulami
Trembulaková, Pavla ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Dejmek, Milan (oponent)
RNA virus SARS-CoV-2 způsobil celosvětovou pandemii závažné nemoci COVID-19, která trvala více než rok. Opravné mechanismy tohoto viru během replikace výrazně snižují účinnost běžně používaných léků z kategorie nukleotidových analog jako je například remdesivir. Nestrukturální protein (nsp) 14 a nsp10 tvoří komplex, který plní exonukleázovou (ExoN) funkci a dále bude nazýván jako ExoN komplex. Nsp14 obsahuje aktivní místo komplexu, nsp10 je kofaktorem. Tento ExoN komplex a je pravděpodobně důvodem nižší účinnosti inkorporace nukleotidových analog v porovnání s viry bez exonukleáz. Tento komplex dvou proteinů s aktivním místem ve struktuře nsp14 obsahujícím dva hořečnté ionty se jeví jako dobrý cíl pro potenciální inhibitory ExoN aktivity a následného znemožnění vzniku dalších životaschopných generací viru. Mezi potenciální inhibitory tohoto ExoN komplexu patří isobavachalcon a sofalcon. Podle publikovaných studií tyto malé molekuly chelatují hořečnaté ionty v aktivním centru exonukleázové části nsp14, čímž inaktivují aktivní centrum ExoN komplexu a znemožní mu fungovat jako opravný prvek syntézy nové RNA. Tato práce se zaměřuje na charakterizaci chování proteinového komplexu nsp10 a nsp14 viru SARS-CoV-2 za přítomnosti malých vybraných molekul, isobavachalconu a sofalconu. Rovněž byly provedeny testy...
|
|
|
Methyltransferázy lidských +ssRNA virů
Skořepa, Jan ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Otava, Tomáš (oponent)
Cílem této bakalářské práce je podat strukturní popis virových methyltransferáz u významných lidských +ssRNA virů, především z čeledi Coronaviridae a Flaviviridae. Nemocemi jako je horečka Dengue, žlutá zimnice, nebo japonská encefalitida (Flaviviridae) se ročně nakazí přes 400 milionů lidí. Při současné pandemii viru SARS-CoV-2 (Coronaviridae) se po celém světě nakazilo již více než 750 milionů lidí. Methyltransferázy se podílejí na vytvoření tzv. čepičky na 5' konci virové RNA. Čepička je struktura, která zvyšuje stabilitu a usnadňuje translaci RNA. Znalost struktury a funkce proteinů NS5 (methyltransferáza u Flaviviridae), nsp14 a nsp16 (methyltransferázy u Coronaviridae), je nezbytná pro navazující vývoj jejich inhibitorů. Ty by jako antivirotika mohly pomoci s léčbou virových onemocnění způsobených koronaviry a flaviviry.
|
|
|
Characterization of a recombinant exonuclease nsp14 of the SARS-CoV-2
Vaško, Michal ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Kohoutová, Klára (oponent)
Koronaviry jsou obalené viry s genomem tvořeným jednovláknovou molekulou RNA v pozitivní formě. S velikostí genomu, u některých druhů, přesahující 30 kb představují největší známé RNA viry. Infikují ptáky a savce včetně člověka a způsobují široké spektrum onemocnění. Většina lidských koronavirů způsobuje převážně mírné respirační infekce. Za poslední dvě desetiletí však došlo ke dvěma rozsáhlým epidemiím a globální pandemii vážných respiračních onemocnění, v mnoha případech končících smrtí, způsobených koronaviry. Nejnovější a nejrozsáhlejší z nich byla způsobena koronavirem SARS-CoV-2 (z angl. Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus). V genomu koronavirů se nachází gen kódující nestrukturní protein 14 (nsp14), který má 3'-5' exonukleázovou a metyltransferázovou enzymatickou aktivitu. Exonukleáza nsp14 se účastní oprav nesprávně zařazených nukleotidů během replikace virového genomu a její přítomnost je u RNA virů velmi výjimečná. Exonukleázová aktivita nsp14 je výrazně podpořena vazbou dalšího virového proteinu, nsp10, který nemá enzymatickou aktivitu, ale je významným kofaktorem pro několik enzymaticky aktivních koronavirových nsps. Nsp14 i nsp10 jsou vysoce konzervované a sekvenčně podobné mezi jednotlivými druhy koronavirů. Pro charakterizaci exonukleázové aktivity nsp14 a její...
|
|
|
Virové proteiny v replikaci RNA
Černý, Prokop ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Faltová, Lenka (oponent)
Patogenní lidský koronavirus SARS-CoV-2 (z angl. Severe Accute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) způsobil v posledních letech celosvětovou pandemii vysoce infekčního onemocnění COVID-19 (z angl. coronavirus disease 2019). Podle Světové zdravotnické organizace bylo k 20. srpnu 2023 zaznamenáno téměř 770 milionů potvrzených případů a takřka 7 milionů úmrtí spojených s tímto onemocněním. V současné době je však známo pouze malé množství účinných antivirotik, která pomáhají léčit toto onemocnění v již infikovaných pacientech. V této práci proto byla studována interakce hostitelských proteinů 14-3-3 s nukleokapsidovým proteinem viru SARS-CoV-2, jakožto potenciální biologický cíl pro racionální návrh nových antivirotik. Význam této interakce v životním cyklu viru nebyl doposud zcela objasněn, pravděpodobně však má důležitou regulační funkci ovlivňující vícero procesů v napadené buňce. Nukleokapsidový (N) protein SARS-CoV-2 ve své sekvenci obsahuje několik vazebných motivů pro 14-3-3 proteiny, z nichž dva (na pozicích S197 a T205), nejpravděpodobněji zodpovědné za interakci mezi těmito proteiny, byly studovány v této práci. Pro určení afinity jednotlivých fosforylačních míst na N proteinu k proteinu 14-3-3ζ byla provedena termoforéza v mikroměřítku. Jako klíčový fosforylovaný zbytek zodpovědný za vazbu...
|
|
|
Strukturní a funkční charakterizace inhibice koronavirové methyltransferázy.
Ivanovská, Dana ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Faltová, Lenka (oponent)
Koronavirové methyltransferasy se účastní modifikace 5'-konce virové RNA. Svou enzymatickou aktivitou zajištují nejen účinnou translaci virových proteinů, ale také maskují vlastní RNA před imunitním systémem hostitele. Tato práce se zaměřuje na methyltransferasy SARS-CoV-2 (methyltransferasová doména nestrukturního proteinu 14, MT14 a nestrukturní protein 16 spolu s jeho kofaktorem - nestrukturní protein 10, nsp16/10), které představují atraktivní cíle pro terapeutický zásah. Cílem této práce byla strukturní charakterizace koronavirových methyltransferas v komplexu s různými malými molekulami. Rekombinantně připravené proteiny byly purifikovány a následně podrobeny krystalizačním experimentům. Získané krystaly heterodimeru nsp16/10 v komplexu se sinefunginem byly namáčeny do roztoku obsahujícího nukleotidový analog S-adenosyl-L-homocysteinu. Optimalizací identifikovaných primárních krystalizačních podmínek MT14 s dvěma různými inhibitory byly získány krystaly vhodné pro měření jejich difrakce a následnou strukturní analýzu. Získaná strukturní data budou sloužit jako podklad pro návrh nových inhibitorů cílících na S-adenosyl- L-methionin vazebné místo nsp14. Klíčová slova: methyltransferasa, nsp14, nsp16, koronavirus, SARS-CoV-2, rekombinantní exprese, krystalizace proteinů
|
|
| |
|
|
Structural and functional study of viral RNA polymerases
Dubánková, Anna ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Plevka, Pavel (oponent)
Virové RNA dependentní RNA polymerázy (RdRp) jsou enzymy nezbytné pro množení RNA virů. Obecná funkce RdRp je pro všechny RNA viry stejná: RdRp rozpozná virovou RNA, nasedne na ni a syntetizuje komplementární řetězec RNA. Série těchto kroků je pro virovou infekci naprosto nepostradatelná. Je důležité si uvědomit, že neinfikovaná buňka RNA nereplikuje. Hostitelská buňka přirozeně neexprimuje žádné RdRp. Pro můj výzkum jsem si vybrala RdRp, protože jsou nezbytné pro virovou replicakci a tudíž excelentní cíl pro virovou terapii. V této studii jsou do hloubky charakterizovány polymerázy z rodiny picornavirů a flavivirů. Picornavirová replikace je lokalizovaná ve viry indukovaných, membránových strukturách, které nazýváme replikační organely (RO). V těchto RO je virová polymeráza lokalizovaná na membráně. Nalezli jsme podmínky, ve kterých se polymeráza váže na membránu. Následně byla studována aktivace picornavirových polymeráz, která je indukována inzercí první aminokyseliny do středu proteinu. V této studii jsou rovněž diskutovány RdRp z rodiny flavivirů, konkrétně z viru žluté zimnice (YFV) a Zika viru (ZIKV). Studie prezentuje první strukturu polymerázy z YFV (v plné délce) a model ZIKV polymerázy v komplexu s RNA. Model ZIKV poskytuje strukturní informaci o aktivním místě potřebnou k "dockingu" ligandů.
|
host ::
RSS.