|
|
Markery transplantační tolerance po transplantaci ledviny
Krepsová, Eva ; Viklický, Ondřej (vedoucí práce) ; Krejčí, Karel (oponent) ; Živný, Jan (oponent)
Pro dlouhodobé přijetí transplantované ledviny je zatím nezbytná dlouhodobá účinná imunosuprese, která však s sebou nese řadu nežádoucích účinků. Naopak, při její nedostatečnosti hrozí rejekce a selhání funkce štěpu. Proto se hledají nové biomarkery, které by odrážely imunologický stav pacienta, a umožnily by tak individualizovat imunosupresivní léčbu. Prokázali jsme, že pacienti po transplantaci ledviny po indukci králičím anti-thymocytárním globulinem (rATG) či basiliximabem měli snížený výskyt akutní rejekce 3 měsíce po transplantaci. Po rATG došlo v periferní krvi příjemců k hluboké depleci T a NK lymfocytů a poklesu exprese genů výhradně exprimovaných těmito buňkami zároveň s výraznou expanzí regulačních T lymfocytů (Treg) v CD4+ kompartmentu. Indukce rATG byla dále krátce po transplantaci spojena se zvýšením dvou transkriptů asociovaných s rejekcí (MAN1A1 a TLR5). Po indukci basiliximabem jsme v krvi přechodně detekovali CD4+CD25low/-FoxP3+ populaci současně s vymizením CD4+CD25+FoxP3+ Treg. Absolutní počty CD4+FoxP3+ Treg po basiliximabu byly přechodně zvýšené a tato léčba byla také spojená s vyšší expresí genů FOXP3 a TCAIM. Dále jsme pozorovali vyšší poměr CD4+FoxP3+ Treg k CD8+CD45RA+CD62L- efektorovým T lymfocytům v potransplantačním období u pacientů s indukcí basiliximabem, kteří během...
|
|
|
Vlastnosti specifických protilátek prionových chorob a možnosti jejich využití
Šafaříková, Eva ; Holada, Karel (vedoucí práce) ; Mareš, Michael (oponent) ; Živný, Jan (oponent)
Souhrn Transmisivní spongiformní encefalopatie (TSE) jsou neurodegenerativní onemocnění charakterizovaná ukládáním patologické formy prionového proteinu (PrPTSE ) v mozku. V současnosti je PrPTSE jediný specifický biochemický marker lidských a zvířecích TSE. Laboratorní diagnostika je založena na průkazu rezistentního jádra PrPTSE (PrPres) po štěpení vzorku mozkového homogenátu proteinázou K. PrPres je posléze detekován pomocí western blotu nebo imunometodami. Obě metody jsou však obtížně standardizovatelné, časově náročné a nejsou schopné zachytit k proteolytickému štěpení senzitivní formy PrPTSE . V této práci jsme se zaměřili na přípravu nového typu testů založených na průkazu PrPTSE bez nutnosti štěpení proteinázou K či jiným enzymem. Působením glukózy a jiných redukujících cukrů v organismu vzniká spektrum produktů zvaných koncové produkty glykace. Vzhledem k dlouhodobému ukládání prionových depozit v mozku dochází ke glykaci i u PrPTSE . Detekce glykovaného PrPTSE by tak mohla sehrát roli diagnostického markeru. V rámci první části studie jsme se zaměřili na přípravu monoklonálních protilátek specifických pro glykovaný prionový protein. Připravili jsme bakteriálně exprimovaný rekombinantní lidský prionový protein (rhPrP). Na rhPrP jsme působili kyselinou glyoxalovou za vzniku karboxymethyl...
|
|
|
Využití nových genomických technik ve studiu patogeneze vybraných vzácných dědičných onemocnění.
Nosková, Lenka ; Kmoch, Stanislav (vedoucí práce) ; Sedláček, Zdeněk (oponent) ; Živný, Jan (oponent)
Vzácná onemocnění jsou heterogenní skupinou onemocnění, jejichž molekulární podstata je často neznámá. Pro jejich studium nebyly donedávna z důvodů malého počtu pacientů k dispozici vyhovující metodické postupy. Díky novým přístupům ke studiu genomu, především díky technologiím DNA čipů a s rozmachem sekvenování nové generace, je v současné době možno studovat vzácná onemocnění i u jednotlivých rodin nebo u sporadických případů. Tato dizertační práce se zabývá aplikací nových genomických technik při studiu vzácných dědičných chorob. Popisuje využití technologie DNA čipů pro účely vazebné analýzy, analýzy změn genové exprese, analýzy změn počtu kopií a homozygotního mapování a dále využití sekvenování nové generace. Kombinace těchto metodických postupů byly použity pro studium molekulární podstaty adultní formy neuronální ceroidní lipofuscinózy, Rotorova syndromu, izolovaného defektu ATP syntázy a mukopolysacharidózy typu IIIC.
|
|
|
Studium molekulární podstaty vybraných dědičně podmíněných onemocnění
Hartmannová, Hana ; Kmoch, Stanislav (vedoucí práce) ; Krebsová, Alice (oponent) ; Živný, Jan (oponent)
Vzácná onemocnění jsou klinicky a geneticky heterogenní skupinou onemocnění postihující různé orgány a projevující se v různém věku. Nalézání, charakterizace a studium funkčních dopadů genetických příčin vzácných onemocnění je efektivním nástrojem odhalování funkce lidských genů a genových produktů a otevírá cestu k pochopení molekulárně-biologických mechanismů jednotlivých onemocnění. Znalost příčin a mechanismů vzniku vzácných onemocnění je následně východiskem pro jejich efektivní diagnostiku, cílenou léčbu a prevenci a zároveň poskytuje i poznatky pro pochopení genetických a molekulárních příčin komplexních onemocnění. Tato dizertační práce dokumentuje základní koncepční a metodický vývoj postupů biochemické genetiky, funkčního klonování, genetického mapování, pozičního klonování, DNA čipů a genomového sekvenování, které jsou dnes základními nástroji efektivního studia všech geneticky podmíněných onemocnění. Rychlý technologický vývoj a praktická využitelnost řady těchto technik je demonstrována na případech studia molekulární podstaty několika vzácných chorob - deficitu adenylosukcinát lyázy, mukopolysacharidózy typu IIIC, Rotorova syndromu, deficitu ATP syntázy, adultní formy neuronální ceroidní lipofuscinózy, GAPO syndromu a X-vázané restriktivní kardiomyopatie, na jejichž objasnění jsem se...
|
|
|
Expression and function of cellular prion protein in blood cells
Glier, Hana ; Holada, Karel (vedoucí práce) ; Živný, Jan (oponent) ; Rusina, Robert (oponent)
Buněčný prionový protein (PrPc) je nezbytný pro patogenezi neurodegenerativních prionových onemocnění. V současné době jsou známy čtyři případy přenosu variantní Creutzfeldt-Jakobovy choroby krevní transfuzí. Objasnění vlastností a množství PrPc na krevních buňkách je předpokladem pro vývoj testu pro detekci prionových chorob v krvi. Průtoková cytometrie představuje potenciální detekční metodu, nicméně výsledky studií zabývajících se množstvím PrPc na lidských krevních buňkách jsou rozporuplné. V této práci jsme ukázali, že většina PrPc v klidových destičkách se nachází intracelulárně a je přítomna v α-granulích. Lidské destičky a červené krvinky nesou významné množství PrPc a mohou tak hrát roli při přenosu prionů krevní transfuzí. Naše výsledky naznačují, že PrPc na červených krvinkách je modifikován. Podobná modifikace patologického prionového proteinu by mohla ovlivnit detekci prionových chorob v krvi. Dále jsme ukázali, že skladování krve před vlastní analýzou a výběr prionových protilátek výrazně ovlivňuje detekci PrPc metodou průtokové cytometrie, a že destičkový satelitismus ovlivňuje detekci PrPc na krevních buňkách. Prokázali jsme, že část PrPc přítomná na leukocytech cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) je s buňkami volně asociovaná a uvolní se během izolace buněk. Dále jsme studovali...
|
|
|
Mechanismus, regulace a využití TRAILem indukované apoptózy nádorových buněk
Horová, Vladimíra ; Anděra, Ladislav (vedoucí práce) ; Truksa, Jaroslav (oponent) ; Živný, Jan (oponent)
Člen proteinové rodiny faktorů příbuzných s TNF - transmembránový ligand TRAIL (tumour necrosis factor-related apoptosis inducing ligand) - přitahuje pozornost díky své schopnosti specificky a efektivně vyvolávat apoptotickou smrt u různých typů rakovinných buněk. Přesto se často setkáváme se sekundární rezistencí, kterou rakovinné buňky vyvíjejí k působení ligandu TRAIL, přičemž molekulární mechanizmy související s tímto jevem nejsou doposud uspokojivě objasněny. V první publikaci jsme se zaměřili na analýzu role endozomální acidifikace v proximálních signalizačních drahách ligandu TRAIL. Pomocí specifických inhibitorů bafilomycinu A1 (Baf A1) a konkanamycinu A (CCA) jsme u několika vnímavých kolorektálních buněčných linií zablokovali vakuolární ATPázu, která zodpovídá za vnitřní okyselování endocytických váčků a lyzozómů. Zjistili jsme, že citlivost takto ošetřených buněk k cytotoxickému působení ligandu TRAIL je významně a reproducibilně potlačena. Buňky vykazovaly minimální štěpení prokaspázy-8 a výrazně zpomalena (i když pouze dočasně) byla i agregace receptorových komplexů a jejich pohyb po buňce v klatrinem obalených váčcích. Povrchová exprese receptorů TRAIL-R1/DR4 a TRAIL-R2/DR5, jejich internalizace po navázání ligandu TRAIL i aktivace antiapoptotických NF-κB a MAP kinázových...
|
|
|
Role genu WT1 a jeho izoforem v hematopoeze a leukemogenezi
Kramarzová, Karolina ; Trka, Jan (vedoucí práce) ; Pospíšilová, Dagmar (oponent) ; Živný, Jan (oponent)
59 Souhrn Vysokou expresi genu Wilmsova tumoru 1 (WT1) nacházíme u většiny akutních leukémií a dalších hematologických malignit. WT1 je proto považován za potenciální univerzální marker minimální reziduální nemoci (MRN), zejména u pacientů s akutní myeloidní leukémií (AML). Jiné studie však tyto výsledky nepotvrdily a role genu WT1 ve sledování MRN stejně jako jeho prognostická signifikance tak zůstávají stále nejasné. Existuje více než 36 variant genu WT1, které mají odlišné, částečně se překrývající funkce a jejich poměr významným způsobem ovlivňuje výslednou funkci WT1. Vzhledem k nedostatku publikovaných dat a absenci relevantní metodiky však doposud nebyl objasněn konkrétní význam expresního profilu izoforem WT1. V rámci hlavního cíle této práce jsme vyvinuli unikátní metodiku pro kvantifikaci 4 hlavních izoforem WT1 a stanovili jejich expresní profil ve vzorcích pacientů s AML, myelodysplastickým syndromem (MDS) a zdravých kontrol. Expresní vzorec izoforem WT1 se liší mezi konkrétními diagnózami, ale v rámci daného typu malignity je překvapivě uniformní a nezávisí na hladině celkového WT1. Neprokázali jsme souvislost profilu izoforem WT1 s prognózou pacientů. Naším dalším cílem bylo definitivní stanovení prognostického významu celkové exprese WT1 u dětské AML v rámci mezinárodní spolupráce. Výsledky...
|
|
|
Apoptóza nádorových buněk: role TRAILu a kaspásy 10
Truxová, Iva ; Živný, Jan (vedoucí práce) ; Anděra, Ladislav (oponent)
Jednou z klíčových vlastností nádorových buněk je schopnost uniknout programované buněčné smrti (apoptóze). V mnoha typech nádorových buněk byly nalezeny somatické mutace proapoptotických genů, které deregulují (inaktivují) apoptózu. Kaspáza 10 je iniciátorová kaspáza, jejíž fyziologická funkce není stále dobře prozkoumána. Také její schopnost nahradit kaspázu 8 v apoptotické signalizaci indukované receptory smrti zůstává kontroverzní. Ovšem některé nalezené mutace v CASP10 genu, které byly spojeny s defekty v apoptóze (79, 81), napovídají, že i tato kaspáza by mohla být klíčová pro iniciaci apoptózy. V naší laboratoři byla u Jurkat (lidská T-buněčná akutní lymfoblastická leukémie) klonu rezistentního na TRAIL - J-TR1 nalezena heterozygotní mutace v CASP10 genu, která ovlivňuje aminokyselinové složení poblíž aktivního místa enzymu. Cílem této práce bylo potvrdit mutaci ARMS-PCR a zjistit, zda bude nadprodukce normální (nemutované) resp. mutované kaspázy 10 D v TRAIL senzitivních resp. TRAIL rezistentních Jurkat buňkách (J-WT resp. J-TR1) ovlivňovat apoptózu indukovanou TRAILem. Mutace byla potvrzena. Byly vypěstovány stabilní klony J-WT resp. J-TR1 buněk transfekované expresním vektorem s vloženou nemutovanou resp. mutovanou CASP10 D (CASP10 D WT resp. MUT). Nadprodukce mutované kaspázy 10 D v J-WT klonech...
|
|
|
Genový polymorfismus Th1/Th2 cytokinů u pacientek s děložní myomatózou
Sosna, Ondřej ; Kužel, David (vedoucí práce) ; Živný, Jan (oponent) ; Novotný, Zdeněk (oponent)
Úvod: Děložní myom (leiomyom) je nejčastěji se vyskytujícím nezhoubným nádorem v oblasti ženského genitálního traktu a představuje nejčastější indikaci k provedení hysterektomie. Jeho etiologie však stále zůstává neznámá. V posledních letech jsou podrobněji zkoumány genetické faktory podílející se na vzniku děložních myomů. Cílem naší práce bylo najít možné genetické faktory použitelné jako prognostický marker k evaluaci zvýšeného rizika vzniku tohoto onemocnění. Metodika: Do studie jsme zařadili 102 pacientek s děložními myomy, jako kontrolní skupina sloužil soubor 145 zdravých žen. Všem těmto ženám bylo provedeno ultrazvukové vyšetření malé pánve a odebrán vzorek nesrážlivé krve. Ve skupině pacientek s děložním myomem následovala vždy po zvolené operační intervenci histologická verifikace nálezu. Princip detekce polymorfismů cytokinových genů byl založen na jednoduché PCR reakci s využitím sekvenčně specifických primerů. Výsledky: Porovnali jsme široké spektrum SNP (z angl. single nucleotide polymorphisms) TH2/Th2 cytokinových genů celého souboru pacientek s kontrolním souborem. Frekvence většiny testovaných SNP nedosáhla u pacientek statisticky významného rozdílu. Našli jsme však zajímavý rozdíl v distribuci genotypů promotoru genu pro IL-4. Genotyp CC v pozici - 590 a -33 byl zastoupen u pacientek s...
|
|
|
Vztah koncentrace vybraných markerů zánětu a endotelové dyskunkce k předčasnému porodu a fetálnímu zánětu
Koucký, Michal ; Hájek, Zdeněk (vedoucí práce) ; Krofta, Ladislav (oponent) ; Živný, Jan (oponent)
Dizertační práce je zaměřena na úlohu zánětu v patogenezi předčasného porodu. V první části práce jsme se popsali současný náhled na patofyziologii předčasného porodu. V druhé části jsme se zabývali hodnocením vztahu vybraných markerů zánětu a endotelové dysfunkce k předčasnému porodu a fetální zánětlivé odpovědi. Nejvýznamnějšími zjištěními naší práce bylo snížení hladin matrixmetaloproteinázy-2 ( MMP-2 ) a snížení hladin sRAGE ve skupině žen s předčasným porodem proti kontrolní skupině těhotných. Podobně jsme prokázali snížení hladin MMP-2 u žen s následně diagnostikovanou fetální zánětlivou odpovědí. sRAGE je současnosti řazen mezi patttern recognition receptors. V případě sRAGE jsme navázali na výsledky našeho pilotního projektu, kdy lze předpokládat, že za jeho nízkými hladiny stojí konzumpce produkty poškození tkání. Potvrdili jsme tak, že hraje důležitou roli v patogenezi předčasného porodu. U MMP-2 předpokládáme abnormální regulační mechanismy tvorby tohoto enzymu. V obou případech bude však potřeba dalších prací k osvětlení funkčního významu našich výsledků.
|
host ::
RSS.