|
|
Studium změn energetického metabolismu hepatocytů: působení oxidačního stresu a trijodtyroninu
Endlicher, René ; Červinková, Zuzana (vedoucí práce) ; Kalous, Martin (oponent) ; Rauchová, Hana (oponent)
SOUHRN Studium změn energetického metabolismu hepatocytů: působení oxidačního stresu a trijodtyroninu Játra jsou životně důležitým orgánem, vzhledem ke svému postavení v cirkulaci se dostávají ve zvýšené míře do styku s řadou toxických látek, které mohou způsobit poškození hepatocytů. Mechanismy odpovědné za poškození hepatocytů jsou různé, avšak jedním z nejvýznamnějších mechanismů hepatotoxického účinku je oxidační stres způsobený zvýšenou produkcí volných radikálů. Jedním z cílů působení toxických látek je respirační řetězec mitochondrií s následným narušením energetického metabolismu buňky. Působení oxidačního stresu na buňky je velmi komplexní a jeho mechanismy nejsou dosud zcela objasněny. Cílem naší práce bylo proto sledovat dopad oxidačního stresu na energetický metabolismus hepatocytů na modelu izolovaných buněk a izolovaných mitochondrií. Hodnotili jsme vliv oxidačního stresu na aktivitu enzymů dýchacího řetězce a na funkci mitochondriálního póru přechodné permeability (MPTP - mitochondrial permeability transition pore), jehož otevření indukuje kaskádu apoptotických a nekrotických procesů. Získané výsledky prokázaly selektivní působení oxidačního stresu na aktivitu enzymů dýchacího řetězce. Tert-butylhydroperoxid (t-BHP) signifikantně inhibuje oxidaci NADH- dependentních substrátů, zatímco oxidace...
|
|
|
Mitochondrial ATP synthase deficiencies of a nuclear genetic origin
Karbanová, Vendula ; Houštěk, Josef (vedoucí práce) ; Kalous, Martin (oponent) ; Rossmeisl, Martin (oponent)
ATP syntáza je klíčový enzym buněčného metabolismu a defekty ATP syntázy patří k nejzávažnějším mitochondriálním onemocněním postihujícím dětskou populaci. Cílem této práce bylo identifikovat genetické defekty a popsat patogenní mechanismy narušení biosyntézy ATP syntázy, které vedou k izolované deficienci tohoto enzymu a projevují se jako mitochondriální encefalomyopatie s nástupem v novorozeneckém věku. Studie skupiny 25 pacientů vedla k identifikaci dvou jaderných genů zodpovědných za deficienci ATP syntázy. První postižený gen byl TMEM70 kódující neznámý mitochondriální protein. Tento protein byl popsán jako nový asemblační faktor ATP syntázy, první specifický pro vyšší eukaryota. Jeho velikost je 21 kDa, nachází se ve vnitřní mitochondriální membráně a není přítomný v tkáních pacientů. Mutace v TMEM70 genu byla nalezena u 23 pacientů a ukázala se být nejčastější příčinou deficience ATP syntázy. Studie na buněčných kulturách ukázaly, že defekt enzymu vede ke kompenzačně-adaptačnímu zvýšení komplexů IV a III respiračního řetězce způsobenému posttranskripční regulací jejich biosyntézy. Druhým postiženým genem byl ATP5E, který kóduje malou strukturní epsilon podjednotku ATP syntázy. Záměna konzervovaného Tyr12 za Cys způsobuje významný pokles obsahu ATP syntázy, ale zároveň akumulaci hydrofobní...
|
|
| |
|
|
Zastoupení komponent ATP synthasomu v různých tkáních potkana a u pacientů s defektem ATP synthasy
Mikulová, Tereza ; Houštěk, Josef (vedoucí práce) ; Kalous, Martin (oponent)
Komplexy oxidační fosforylace (OXPHOS) vytváří v rámci vnitřní mitochondriální membrány vyšší strukturní a funkční celky, tzv. superkomplexy, které umožňují cílené směrování substrátu z jednoho komplexu na druhý. I ATP synthasa je schopna organizovat se do komplexnějších struktur. V savčích mitochondriích se běžně vyskytuje v dimerní podobě, existují důkazy o její trimerizaci a dokonce i tetramerním uspořádání. Ukazuje se, že dochází i k vzájemnému propojení komponent mitochondriálního fosforylačního aparátu tvořeného ATP synthasou katalyzující fosforylaci ADP na ATP, přenašečem adeninových nukleotidů (ANT) zabezpečujícím výměnu nasyntetizovaného ATP za ADP přes vnitřní mitochondriální membránu a fosfátovým translokátorem (PiC), který umožňuje import anorganického fosfátu (Pi) do matrix mitochondrie. Tyto komponenty by mohly vytvářet superkomplex, tzv. ATP synthasom, který by zvyšoval efektivitu jednotlivých procesů vedoucích k tvorbě ATP. V této práci byly nejprve sledovány obsahy složek fosforylačního aparátu v souvislosti s rozdílným obsahem ATP synthasy v mitochondriích izolovaných celkem z devíti tkání potkana. Proteiny z izolovaných mitochondrií byly separovány pomocí elektroforéz za denaturujících podmínek (SDS-PAGE) a jejich množství byla analyzována specifickými protilátkami. Podle...
|
|
|
Nefarmakologické přístupy k léčbě mitochondriálních onemocnění
Kudrnovská, Barbora ; Mráček, Tomáš (vedoucí práce) ; Kalous, Martin (oponent)
Mitochondriální onemocnění se vyznačují vysokou mírou genotypové i fenotypové heterogenity, jako celek se však řadí mezi jedny z nejčastějších vrozených metabolických poruch. Léčba těchto onemocnění je zatím velmi omezená, ačkoliv probíhá řada výzkumů nových terapeutických přístupů. Kromě farmakologických metod, existují i přístupy nefarmakologické, jako je zařazení určitých dietních režimů, fyzické aktivity či vystavení se hypoxii. Vzhledem ke spíše obecnému mechanismu působení, tak mohou tyto metody nabídnout benefity širšímu spektru mitochondriálních pacientů, a to i přes odlišné primární defekty. Tato práce shrnuje dosavadní poznatky o využití cvičení, ketogenní diety a aplikaci hypoxie jako možných terapeutických přístupů v léčbě mitochondriálních onemocnění. Klíčová slova: mitochondrie, mitochondriální onemocnění, terapie, cvičení, ketogenní dieta, hypoxie
|
|
|
Regulation and Disorders of Mammalian Cytochrome c Oxidase
Kovářová, Nikola ; Houštěk, Josef (vedoucí práce) ; Stibůrek, Lukáš (oponent) ; Kalous, Martin (oponent)
Cytochrom c oxidáza (COX) je koncovým enzymovým komplexem dýchacího řetězce a vyskytuje se ve vnitřní mitochondriální membráně jako monomer, dimer a ve formě respiračních superkomplexů. Asemblační proces COX je komplikovaný, vysoce regulovaný a závisí na mnoha pomocných proteinech. Mutace COX podjednotek, kódovaných mitochondriální nebo jadernou DNA, nebo mutace v genech pro COX asemblační proteiny jsou častopu příčinou závažných mitochondriálních onemocnění. SURF1 protein je zapojen do počátečních fází tvorby COX, ale jeho přesná funkce není objasněna. Mutace lidského SURF1 genu vedou k těžkému defektu COX a fatálnímu neurodegenerativnímu onemocnění, Leigh syndromu. Knockout SURF1 genu u myši způsobuje také izolovaný COX defekt, ale méně výrazný a bez postižení CNS. Cílem práce byla detailní analýza narušené COX biogeneze vyvolané mutací nebo knockoutem SURF1 genu, od tvorby COX monomeru a vestavění COX do superkomplexů až po ovlivnění ostatních OXPHOS komplexů izolovaným defektem COX. Mutace SURF1 genu ve fibroblastech pacientů vedly k výrazné akumulaci asemblačního intermediátu COX a defektu tvorby funkčního COX monomeru, který se preferenčně vázal do I-III2-IV1 superkomplexu. COX deficience následně vedla ke zvýšení obsahu OXPHOS komplexů I, III a V. U SURF1-/- myší byl COX defekt výrazně...
|
|
|
Vztah n-3 polynenasycených mastných kyselin a buněčných senzorů energetického stavu AMPK a SIRT1
Zouhar, Petr ; Kalous, Martin (oponent)
Vztah n-3 polynenasycených mastných kyselin a buněčných senzorů energetického stavu AMPK a SIRT1 Petr Zouhar Abstrakt Při regulaci metabolických procesů hrají významnou roli regulační proteiny schopné zpětnovazebně reagovat na energetický stav buňky. Velká pozornost je věnována AMP aktivované kináze (AMPK) a NAD+ aktivované deacetyláze SIRT1. Tyto enzymy spolu vzájemně interagují a jejich stimulace vede mj. k aktivaci mitochondriální biogenezie a oxidace mastných kyselin. Díky tomu působí příznivě proti rozvoji komplikací spojených s obezitou, inzulínovou rezistencí a stárnutím. Hladovění, fyzická námaha i některé antidiabetogenní léky působí prostřednictvím těchto regulátorů. Polynenasycené mastné kyseliny řady n-3 (n-3 PUFA) jsou rovněž známy svými účinky na mitochondriální biogenezi a β-oxidaci. Z předchozích výsledků naší laboratoře vyplývá, že příjem vysoké dávky n-3 PUFA v potravě vede ke zvýšení aktivity AMPK v bílé tukové tkáni. Data, prezentovaná v této diplomové práci, navíc dokládají, že SIRT1 je nezbytný pro zvýšení exprese genů, jež se podílejí na regulaci β-oxidace (PPARα a další) v reakci na n-3 PUFA. n-3 PUFA dále zlepšují synergisticky v kombinaci s kalorickou restrikcí metabolický profil. Děje se tak pravděpodobně skrze aktivaci SIRT1/AMPK/PGC-1α signalizační kaskády specificky v bílém tuku.
|
|
|
Struktura a fyziologický význam mitochondriálního póru přechodné propustnosti
Eliáš, Jan ; Mráček, Tomáš (vedoucí práce) ; Kalous, Martin (oponent)
Mitochondriální pór přechodné propustnosti (mPTP) je Ca2+ dependentním kanálem nacházejícím se ve vnitřní mitochondriální membráně, který je inhibován nanomolárními koncentracemi imunosupresiva cyklosporinu A. Společně s dalšími interagujícími proteiny, které regulují jeho otevření, utváří mPTP proteinový komplex přechodné propustnosti. Přetrvávající otevření mPTP je doprovázeno bobtnáním mitochondrií a následným kolapsem organely, jež předchází vyplavení proapoptotických proteinů a programované buněčné smrti. Kanál utvářející proteinová jednotka mPTP zůstává i přes intenzivní dlouholetý výzkum neznámá. Napříč historií zkoumání mPTP byl za kanál utvářející jednotku přijímán proteinový komplex ANT-VDAC, samotný protein ANT, PiC i ATP syntáza. I přes skutečnost, že nám doposud není známá přesná strukturní podstata, je mPTP přisuzována role v celé řadě onemocnění a patofyziologických stavů s nimi spojenými. Patří mezi ně zejména role v ischemickém/reoxidačním poškození, nervových a svalových dystrofiích i v nádorovém bujení. Klíčová slova: mitochondrie, mitochondriální pór přechodné propustnosti, cyklosporin A, programovaná buněčná smrt, ATP syntáza, oxidačně fosforylační aparát.
|
|
|
Antioxidant system in hypoxic heart
Sotáková, Dita ; Žurmanová, Jitka (vedoucí práce) ; Kalous, Martin (oponent) ; Babula, Petr (oponent)
Kardiovaskulární onemocnění, zejména akutní infarkt myokardu, je celosvětově nejčastější příčinou úmrtí. Je známo, že adaptace na chronickou hypoxii zvyšuje odolnost srdeční tkáně vůči ischemicko-reperfuznímu (I/R) poškození. Reaktivní formy kyslíku (ROS) hrají důležitou signální roli při aktivaci protektivních drah během I/R, ačkoli přebytek ROS během reperfúze vede k poškození srdeční tkáně. Vzhledem k tomu, že buněčný antioxidační systém je zodpovědný za udržování redoxní homeostázy, bylo cílem této práce analyzovat vztah mezi tolerancí myokardu k I/R poškození a regulací hlavních složek antioxidačních systémů, souvisejících transkripčních faktorů a jejich cílových genů v protektivních a neprotektivních režimech chronické hypoxie. Prokázali jsme rozdíly v kardioprotektivním fenotypu u potkanů vystavených třem režimům chronické hypoxie (FiO2 0,1; 3 týdny). Adaptace na kontinuální (CNH) a intermitentní (CNH-8; 8h/den) režim hypoxie zvýšila rezistenci myokardu k I/R poškození, zatímco 1-hodinové denní přerušení hypoxické adaptace (INH-23) zrušilo kardioprotektivní účinek a snížilo poměr redukovaného a oxidovaného glutathionu (GSH/GSSG). Oba kardioprotektivní režimy významně zvýšily expresi mRNA mitochondriálních antioxidantů (manganová superoxid dismutáza, MnSod; glutathion reduktáza, Gsr;...
|
|
|
Functional characterization of LACE1 APTase and mitochondrial AAA proteases YME1L and AFG3L2 in mitochondrial protein homeostasis.
Tesařová, Jana ; Stibůrek, Lukáš (vedoucí práce) ; Kalous, Martin (oponent) ; Pecina, Petr (oponent)
Udržení mitochondriální proteinové homeostázy je nezbytnou podmínkou pro průběh klíčových buněčných procesů a udržení buněčné integrity. Je zajištěna mnoha specifickými mitochondriálními proteázami s možnými chaperonovými funkcemi aktivních v různých mitochondriálních subkompartmentech. V první části této disertační práce jsme se zaměřili na charakterizaci funkčního překrývání a spolupráce proteolytických podjednotek AFG3L2 a YME1L mitochondriálních komplexů m-a i- AAA lokalizovaných ve vnitřní mitochondriální membráně. Dvojitě utišená buněčná linie AFG3L2/YME1L vykazovala výraznou změnu ve zpracování isoforem OPA1, výrazné zvýšení proteázy OMA1 a snížení proteinu SPG7. Naše výsledky ukazují spolupráci a částečně i nadbytečné funkční překrývání proteáz AFG3L2 a YME1L v udržení mitochondriální proteinové homeostázy, a dále podtrhují jejich důležitost pro mitochondriální a buněčné funkce a integritu. Cílem druhé části bylo charakterizovat buněčnou funkci proteinu LACE1 v mitochondriální proteinové homeostáze. Protein LACE1 je lidský homolog kvasinkové ATPázy Afg1. Z našich výsledků vyplývá, že LACE1 je mitochondriální integrální membránový protein, který existuje jako součást tří komplexů o přibližné molekulové hmotnosti 140, 400 a 500 kDa a zprostředkovává degradaci jaderně kódovaných podjednotek...
|
host ::
RSS.